熒光是一個過程，其中已吸收的光（光子）后的物質(zhì)emitts的輻射的波長（顏色），其中長于吸收光，這個排放停止后立即停止激發(fā)。這種現(xiàn)象是熒光顯微鏡及其應(yīng)用的基本元素。

除此之外，“古典”在光學(xué)顯微鏡下的熒光激發(fā)，有可能兩個或多個光子具有較長wavengths比發(fā)射的激發(fā)激光共聚焦掃描顯微鏡通過現(xiàn)代技術(shù)來獲得相同的發(fā)光效果。

 熒光作為autofluorescenc的生物和/或無機結(jié)構(gòu)或所謂的次級熒光的特殊染料（熒光染料，熒光標(biāo)記物）的處理后的檢體發(fā)生。要執(zhí)行熒光顯微鏡，必須滿足以下要求：**的能量源（高壓汞弧燈，鹵燈等），選擇的激發(fā)光發(fā)出的輻射**的足夠的透射濾光器的系統(tǒng)（filterblocks）的，，*后但并非*不重要的是，適用于熒光，即集電極鏡頭，照明，分光鏡，目標(biāo)，管鏡頭和目鏡光學(xué)零件和服裝。

與今天的情況相比，在*次施加透射光場和暗場顯微鏡的使用熒光顯微鏡。這是由于其有限的護林員在那些日子里的應(yīng)用。但隨著組織學(xué)，細(xì)胞學(xué)，分子生物學(xué)和免疫診斷其重要性日益增加的需求，從根本上改善照明和觀測技術(shù)來越來越多。這是入射光熒光顯微鏡誕生的時刻。

在其近40年的應(yīng)用和發(fā)展的過程中，這種技術(shù)成為常規(guī)和科研工作，在生物學(xué)，醫(yī)學(xué)，科學(xué)和工業(yè)的基本工具之一。入射光熒光顯微鏡的進步，尤其是由研究工作Ploem的他的功能引領(lǐng)趨勢也正向萊茨RESP戰(zhàn)略決定。韋茨拉爾徠卡光學(xué)儀器發(fā)展需要。

這個發(fā)展過程中是按時間順序描述在目前的貢獻(xiàn)。à提要熒光顯微鏡技術(shù)使顯微鏡，目標(biāo)，熒光染料，光源和過濾系統(tǒng)有關(guān)的應(yīng)用領(lǐng)域，并指這方法的相關(guān)信息。

圖 1a的：熒光多wavelenghts的落射照明器與四個二色光束分離器安裝在一個滑塊上，用紫外線入射照明，紫色，藍(lán)色和綠色的激發(fā)光的。建在阿姆斯特丹大學(xué)（Ploem，1965）。

圖 1b中：萊茨原型（沒有商業(yè)化的）與4個二向色分束器安裝在一個滑塊（Ploem，1967）的多波長的落射照明。

圖 1C：萊茨落射照明器與四個可交換濾光塊（塊）（卡夫，1972）。

不久與窄帶藍(lán)色和綠色的光激發(fā)它變得清晰，廣泛應(yīng)用于免疫熒光異硫氰酸酯（FITC）和異硫氰酸四甲（TRITC）標(biāo)簽檢測開辟了*佳的可能性。使用的藍(lán)色和綠色的激發(fā)也*小化的自體熒光的組織成分，與傳統(tǒng)的透射照明用UV光遇到不期望的效果。FITC現(xiàn)在可以興奮與窄帶藍(lán)色光（使用濾除帶外干擾的半寬度為16nm），在490 nm處（長波長藍(lán)色）的*大激發(fā)，清楚地觀察到綠色熒光發(fā)射峰在520納米。*小化組織成分的自體熒光（圖2a和b），在一個高的圖像對比度。激發(fā)FITC接近其*大激發(fā)啟用，即使是高壓汞弧燈，有沒有強烈的排放峰值在藍(lán)色波長范圍內(nèi)，可以用這樣一個高效的激勵。此外，落射照明用的*次啟動，激發(fā)富爾根副薔薇苯胺的強汞（圖3a和b）在546 nm處的發(fā)射譜線的綠色反射分色鏡。

圖 2A：照亮寬波段紫外線激發(fā)與immunolabel（FITC）標(biāo)記的組織細(xì)胞。注意藍(lán)色自發(fā)熒光的組織結(jié)構(gòu)。

圖 2B：相同的組織和相同的免疫染色FITC標(biāo)記落射照明使用窄帶藍(lán)色（490 nm）的光照亮。請注意，增加圖像的對比度（Ploem，1967）。

圖 3A：肝組織。細(xì)胞核染色進行DNA Feulgen反應(yīng)pararosanilin的，可視化與傳輸綠燈。這污點被稱為吸收污漬，不知道是熒光。在晶核上亮起，導(dǎo)致事件窄帶綠光（546 nm）的紅色熒光。

圖 3B：肝組織。核Feulgen反應(yīng)副玫瑰苯胺染色的DNA。落射照明與窄帶綠光（546納米）和二色分光鏡反射綠燈。大概顯微鏡用綠光激發(fā)（Ploem，1965）的*個例子。注意：大的圖像對比度。

在他的第二次出版的多波長落射照明器，描述一個的萊茨原型與四分色光束spittters（圖1b），Ploem 承認(rèn)布倫伯格和Krylova的貢獻(xiàn)[ 2 ]。俄羅斯在這一段時間的研究，沒有任何主要的工業(yè)發(fā)展在俄羅斯或東德落射熒光顯微鏡的交通不便是萊茨沒有意識到這樣的發(fā)展早的原因。引進外延照明，紫外線，雖然有用的幾個應(yīng)用程序，沒有被萊茨一個新的技術(shù)發(fā)展的動機，因為他們已經(jīng)出色的傳輸暗場紫外光激發(fā)的可能性。增加世界廣泛使用的常規(guī)熒光顯微鏡在醫(yī)療診斷和分子生物學(xué)研究，然而，利潤落射照明使用窄帶激發(fā)新的可能性，用藍(lán)色和綠色的光。由于可以使用標(biāo)準(zhǔn)的高壓汞弧燈，這似乎是一個實際的建議。

隨后，徠茲分別紫外線，紫色，藍(lán)色和綠色的光[ 13 ] 開發(fā)了一種新穎多波長熒光epiilluminator的四個旋轉(zhuǎn)分色分光鏡（徠茲PLOEMOPAK） 。萊茨照明（包含四個分色分光鏡）屏障過濾器和旋轉(zhuǎn)炮塔激發(fā)濾光片在連續(xù)幾代增加了。*后一個優(yōu)雅的落射照明，構(gòu)建了卡夫[ 15 ]含有多組的激發(fā)濾光器，二向色分束器和一個阻擋或發(fā)射濾波器的組合，一起安裝在過濾器中的多維數(shù)據(jù)集，也稱為過濾器塊（圖4）。由于此照明燈迅速變成光路允許過濾立方體，多波長照明同款組織成為一個實用的命題。此外，四個過濾器的照明器中的多維數(shù)據(jù)集可被交換由用戶（圖1c）。兩套不同的四個濾光塊進行組裝，選擇從許多濾光塊，包含組合的激發(fā)，阻隔過濾和分色分束器，為不同的應(yīng)用程序開發(fā)。經(jīng)過建議Ploem，利時也產(chǎn)生了一個倒置的顯微鏡落射照明（圖5a和b）。多波長熒光顯微鏡的的萊茨PLOEMOPAK照明的審查，被稱為讀者評論普盧塔

左：圖。4：完成萊茨（徠卡）過濾器的立方體（塊）含有熒光顯微鏡：激發(fā)濾光片，分色分束器和發(fā)射濾波器（壘）。

圖 5A：徠卡倒置熒光顯微鏡，多波長落射照明。

圖 5B：寺崎^?塑料托盤與人類淋巴細(xì)胞移植研究后熒光細(xì)胞毒性試驗。倒置顯微鏡落射照明。

徠茲（徠卡）濾波器立方體系統(tǒng)是如此的高效，現(xiàn)在，39年后，相似類型的過濾器立方體仍然使用多波長熒光顯微鏡*顯微鏡制造商。這種發(fā)展*終導(dǎo)致在徠卡的發(fā)展，自動化的多波長熒光落射照明器，可容納8個濾光塊不同的波長范圍（圖5c）。當(dāng)過濾立方體，電腦顯示器上的像素移位避免或保持在低于35 mm膠片由于0像素移位技術(shù)的分辨能力之間切換。此照明燈是現(xiàn)在使用的熒光原位雜交方法（FISH）染色體的研究。

Ploem [ 24，25，26，27，28 ]，范德Ploeg Ploem的[ 20 ]和奈恩和Ploem [ 18 ]進一步探索過濾器的組合，許多醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也得到了發(fā)展。這樣做是與肖特和Leitz合作。Rygaard和奧爾森等人[ 35 ]開發(fā)了一種新型的短波通高傳輸干擾濾波器具有非常高的傳輸和尖銳切斷對波長大于490納米的藍(lán)色光。

Ploem [ 23 ]結(jié)合SP濾波器與1毫米GG 455過濾器，阻止紫外線激發(fā)，肖特和建議的綠色光激發(fā)和激發(fā)一個過濾器Balzers公司開發(fā)的類似的過濾器（SP 560 = KP 560）紫光（LP 425 = KP 425）。后者過濾器適用于神經(jīng)遞質(zhì)[ 25 ] 調(diào)查。在圖6a和b中得到的藍(lán)色熒光可以觀察到。

圖 5C：徠茲（徠卡）機動落射照明器與八個濾光塊（塊）。

圖 6a的藍(lán)色熒光腎上腺素（加利福尼亞州）的神經(jīng)叢和黃色熒光肥大細(xì)胞（5-HT）所包圍的小血管的大鼠腸系膜。甲醛誘導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)的CA和5-HT的熒光基團的熒光。

圖 6B：相同的組織和染色圖。6A：EPI-窄帶紫色激發(fā)光照明（LP 3毫米GG 400和SP（KP）425干擾過濾器），分色分束器495納米，反映了紫光和屏障過濾器LP 460納米。該過濾器立方體permittted的*次觀察藍(lán)色熒光腎上腺素能神經(jīng)纖維，明顯不同的從黃色熒光肥大細(xì)胞（Ploem，1971）

從眼鏡行業(yè)方面，早對這些發(fā)展中的貢獻(xiàn)和評論寫卡夫[ 14 ]，沃爾特·[ 39，40 ]，特拉普[ 38 ]和赫爾佐格[ 8 ]。

落射熒光顯微鏡中使用的過濾器中定義的主類（一）主要激發(fā)濾光片LP（長傳）和SP（短傳） -德國文學(xué)被稱為KP過濾-及（b）二級過濾器作為屏障過濾器和發(fā)射濾波器等[ 23 ]。后者也被稱為熒光選擇過濾器，例如用于限制FITC熒光峰值在520 nm處觀察到這些。熒光顯微鏡的過濾器已被賦予由賴希曼[ 33 ] *近的一項廣泛的審查。

Cormane [ 3 ]首次證明，窄帶藍(lán)色光落射熒光標(biāo)記FITC免疫人體皮膚疾病的研究中得到*佳的對比度。透射光激發(fā)紫外線燈，用來引起如此強烈的自體熒光在皮膚的彈性纖維，使可視化熒光抗體嚴(yán)重阻礙。

在七十年代的開創(chuàng)性工作萊茨落射熒光顯微鏡恰逢一個世界性的增加免疫和其他分子生物學(xué)方法，像魚在醫(yī)學(xué)診斷和研究中的應(yīng)用。hijmans等。[ 9，10 ]首次證明萊茨新的多波長激發(fā)落射照明的實用性，對于某些類別的免疫球蛋白細(xì)胞的選擇性檢測，使用綠色熒光FITC和紅色熒光TRITC抗體共軛。他們應(yīng)用的兩個波長的激發(fā)方法，使用藍(lán)色和綠色的光的選擇由一個發(fā)射濾光器在520nm處（圖7）的FITC熒光峰值。brandtzaeg [ 1 ]和Klein等。[ 12 ]有類似的發(fā)現(xiàn)，識別免疫重要的細(xì)胞類型，使用雙波長激發(fā)萊茨epiilluminator的。在染色血“玫瑰花結(jié)”的形成，使用UV和綠色的光的兩個波長的激發(fā)方法，可以顯示紅細(xì)胞周圍的單核細(xì)胞（圖8）

圖 7：骨髓細(xì)胞的抗-κB的TRITC共軛的抗-IgG FITC共軛染色。的EPI-illmination窄帶綠色和藍(lán)色光，導(dǎo)致TRITC和綠色熒光的細(xì)胞含有FITC標(biāo)記的細(xì)胞中含有的紅色熒光。一些細(xì)胞中含有FITC和TRITC。

圖 8：人體血液細(xì)胞，“花環(huán)”的形成。藍(lán)色熒光染色芪使用外延照明用紫外光紅細(xì)胞染色。淋巴細(xì)胞激發(fā)后的綠色光（1965）與橙紅色的染色曙紅染色。