徠卡顯微鏡：熒光蛋白 - 從入門到諾貝爾獎
熒光蛋白是*近熒光顯微鏡及其現(xiàn)代應(yīng)用的根本。他們的發(fā)現(xiàn)和隨后的發(fā)展是*令人興奮的創(chuàng)新在上個世紀(jì)的生命科學(xué)和無數(shù)自然現(xiàn)象破譯的起點之一。這篇文章是獻(xiàn)給誰參與了熒光蛋白的命運輸入其科學(xué)的參與到人。它應(yīng)該給一個*美麗的生化工具，從一開始到諾貝爾獎的漫長道路的洞察。
早期的熒光觀察
熒光蛋白的人的興趣可以追溯到公元一世紀(jì)時，羅馬自然哲學(xué)家老普林尼描述[ 1 ]（蓋烏斯皮林紐斯Secundus，公元23年-公元79年）在地中海的一個發(fā)光的水母（Pulmo MARINUS） 。在他的眼睛這些動物發(fā)出的光，其發(fā)光強(qiáng)度，它幾乎可以被用來作為一個火炬（博恩，1855）。除了 這種水母有豐富的其他生物，吸引了我們的注意，因為他們在黑暗中發(fā)光。事實上，他們沒有做到這一點趕上我們欽佩，但其他的理論之中，與他們的同種（螢火蟲發(fā)揮自己的隊友，例如一拉就）溝通，吸引獵物（如蛙魚）或嚇唬天敵（短尾魷魚例如）。這些迷人的生物都生活在黑暗的世界-如深海-燈是一種原始屬性。而上200米的海洋底下的邊境滲透陽光，現(xiàn)存*的照明是由生活在那里的生物。
利用化學(xué)發(fā)光和熒光發(fā)光，演變發(fā)展的*令人印象深刻的和***的工具，這是基于科學(xué)的好奇心幾個人*近的生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)之一。他們的努力，發(fā)現(xiàn)應(yīng)在下面提及。
中世紀(jì)后，隨著即將到來的自然科學(xué)的興趣，喜歡西班牙醫(yī)生和植物學(xué)家尼古拉斯莫納德斯描述一個閃閃發(fā)光的木1565降香nephriticum的提取物制成。后來這種光可以歸因于這是發(fā)現(xiàn)在這家工廠，并表明泛著不僅限于動物黃酮類化合物的氧化產(chǎn)物。三個多世紀(jì)后（1858年），愛爾蘭數(shù)學(xué)家和物理學(xué)家喬治·加布里埃爾·斯托克斯，形成那種自然發(fā)生的現(xiàn)象：熒光的名稱。他認(rèn)為這個詞后的藍(lán)色發(fā)光螢石礦物，并擴(kuò)大了觀察動物在植物石頭的輻射對象
圖 1，2：維多利亞水母。來源：Ssblakely，通過維基共享資源
然而有這個令人費解的問題，為什么會出現(xiàn)藍(lán)色光完整的生物體中提取，而在綠色發(fā)光？下村和他的同事們幾年來解開這個謎。但*后他們的研究表明，藍(lán)色的光芒來自水母，只是另一種閃閃發(fā)光的蛋白 - 水母綠色熒光蛋白（GFP）的能量來源。他們意識到，水母發(fā)光蛋白所發(fā)射的光的吸收，用這種能量產(chǎn)生綠色熒光的綠色熒光蛋白。
圖3：綠色熒光蛋白（GFP）的分子結(jié)構(gòu)
等待下一個開創(chuàng)性步驟凱旋游行的GFP克隆技術(shù)的發(fā)明，在20世紀(jì)70年代。而美國微生物學(xué)家道格拉斯普拉舍的工作，在1992 [ 3 ] 的*次克隆了完整的GFP基因。A.維多利亞cDNA文庫之前，他準(zhǔn)備與他的同事米爾頓科米爾一起在佐治亞大學(xué)的，已經(jīng)知道準(zhǔn)的GFP。不幸的是，由美國癌癥學(xué)會的資助Prashers跑了出來，他才可以開始在細(xì)菌表達(dá)的重組GFP。
由Martin Chalfie的，一位美國生物學(xué)家，誰可以受益于普拉舍的前期工作，初步懷疑，GFP不會在外面工作的水母被抹去。通過引入GFP基因插入大腸桿菌和線蟲，他可以表明，有沒有其他的水母特定的蛋白質(zhì)或必要因素產(chǎn)生綠光[ 4 ]。
GFP在活細(xì)胞成像
有了這些經(jīng)驗，門被打開了綠色熒光蛋白在生命科學(xué)，開始其***的職業(yè)生涯。GFP成為觀察活細(xì)胞和生物合成的標(biāo)簽，而不需要或熒光抗體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。在免疫熒光染色的情況下，在細(xì)胞內(nèi)的抗體的訪問目標(biāo)結(jié)構(gòu)一致來保證。這是通過用洗滌劑（例如），這不可避免地誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的透化細(xì)胞。此外，大多數(shù)抗體變性抗原的偏好。因此，免疫熒光技術(shù)，使用代理，像第甲醛變性細(xì)胞靶蛋白結(jié)構(gòu)。共使用GFP可以克服這些非生理條件和生活細(xì)胞成像鋪平了道路。
另一個人誰是實現(xiàn)和發(fā)展的巨大潛力GFP是錢永健。來自鈣調(diào)節(jié)領(lǐng)域，美國細(xì)胞生物學(xué)家興趣追蹤活細(xì)胞內(nèi)大分子相互作用。劍橋和伯克利在哈佛的學(xué)習(xí)和工作后，他終于落戶在加州大學(xué)，圣迭戈。藥理學(xué)，化學(xué)和生物化學(xué)教授，他GFP的提高了工作效率，通過利用在進(jìn)化過程中的一個非常普遍的原則：突變。1994年，他和他的團(tuán)隊建立了一個單點突變（S65T）GFP一個更好的強(qiáng)度和光穩(wěn)定性比野生型版本。除了明亮的光暈S65T的變異體有另一個引人注目的技術(shù)效益。而野生型GFP有兩個激發(fā)*大值在395納米和475納米，在484 nm處只有一個變異版本。安裝的“新的”綠色熒光蛋白的光譜特性，通過保持其發(fā)射波長在509 nm處，幾乎成古典FITC熒光的屬性（FITCex：496納米，F(xiàn)ITCem：520-530納米）。由于其增強(qiáng)GFP變種被稱為“增強(qiáng)”綠色熒光蛋白或EGFP。
做結(jié)構(gòu)GFP錢學(xué)森和他的同事研究制定進(jìn)一步的熒光衍生物。與GFP結(jié)構(gòu)在他們手中，他們成立的一個變種（T203Y）照耀在明亮的黃色，因此定名為“黃色熒光蛋白”或YFP。其次青色（CFP）和藍(lán)色（BFP）形成。
圖4：線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，青色：CFP，綠色環(huán)保：綠色熒光蛋白，黃色：YFP，紅色：紅色熒光蛋白
圖5：GFP小鼠
珊瑚蟲熒光蛋白
延伸到紅色的頻譜范圍內(nèi)時，生物化學(xué)家 Sergey A. 我們簡直不敢相信，他是自2003年以來，俄羅斯科學(xué)院一名對應(yīng)的成員，發(fā)現(xiàn)紅珊瑚的熒光蛋白的熒光蛋白的調(diào)色板。買完這些刺胞動物門在莫斯科的一家寵物商店盧科亞諾夫研究這些原始的動物運往俄羅斯海洋水族館的熒光行為。其中包括，他發(fā)現(xiàn)紅色熒光的蛋白來自Discosoma的一個Corallimorpharia -他稱之為DsRed的。除了紅色熒光蛋白，簡直不敢相信和他的同事確定其他發(fā)光珊瑚蟲的蛋白質(zhì)生化時間后的使用時間進(jìn)行了優(yōu)化，這是一個整體的調(diào)色板。
諾貝爾文學(xué)獎
所有的努力，研究發(fā)現(xiàn)，理解和增強(qiáng)熒光蛋白導(dǎo)致了大范圍的應(yīng)用在生命科學(xué)的投入。GFP及其變種打開門，科學(xué)家觀看的FE轉(zhuǎn)移或血管生成生物體。此外，的五彩熒光的神經(jīng)（Brainbow）的使用將有助于了解大腦中復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。裝飾瘧疾的病原體瘧原蟲的寄生蟲，如熒光蛋白的可能性，它是可以實現(xiàn)的，看著自己的命運在宿主細(xì)胞。的機(jī)會，可以繼續(xù)的名單幾乎是無止境的，不僅包括臨床相關(guān)的項目，但還有其他基礎(chǔ)科學(xué)的企業(yè)。
總之GFP及其突變體的使用改變了我們的生活和其病理修改在一個戲劇性的方式，2008年化學(xué)諾貝爾獎給他們?nèi)齻€人誰參與了綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展得到了回報。修下村修，馬丁Chalfie的錢永健，裝飾與他們的工作“的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白”在科學(xué)中的*高榮譽。
在化學(xué)（2008），諾貝爾委員會由的M?ns埃倫貝格教授代表“ ...的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展綠色熒光蛋白（GFP）從根本上改變科學(xué)議程。改進(jìn)變種GFP和GFP類似的蛋白質(zhì)協(xié)同的眼睛目前高分辨率顯微鏡，計算技術(shù)和**的理論方法助長了復(fù)雜的生物系統(tǒng)側(cè)重于定量分析的科學(xué)**，現(xiàn)在的世界**看不見的結(jié)構(gòu)和動態(tài)原則逐步外觀影響幾乎所有方面的生物，醫(yī)學(xué)和醫(yī)藥的研究... “
此報價為2008年諾貝爾化學(xué)獎的頒獎辭一次代表當(dāng)前生命科學(xué)和高沖擊的熒光蛋白，在未來即將到來的利用率，也引起我們的好奇心。*近的事態(tài)發(fā)展，像的熒光筆蛋白（photoactivateable光開關(guān)或photoconvertable的FPS）和建立新的*分辨率光學(xué)設(shè)施，如顯微鏡，明確的，即熒光進(jìn)化仍在進(jìn)行中，離終點不遠(yuǎn)。