徠卡顯微鏡：熒光相關(guān)光譜
熒光相關(guān)光譜（FCS）的測量的熒光強(qiáng)度的波動(dòng)，在一個(gè)子femtolitre卷來檢測這樣的參數(shù)，擴(kuò)散時(shí)間，熒光標(biāo)記的分子的分子或暗的狀態(tài)數(shù)。在20世紀(jì)70年代初，該技術(shù)是自主研發(fā)的瓦特·韋伯和魯?shù)婪騌igler。的術(shù)語FCS鑄造，由韋伯實(shí)驗(yàn)室。這項(xiàng)突破性的技術(shù)是引進(jìn)共焦光學(xué)Rigler和同事，在20世紀(jì)90年代初增加其靈敏度單分子水平。隨著更高的靈敏度與激光掃描共聚焦顯微鏡FCS儀表的可用性乘以其效用生物學(xué)。應(yīng)用包括分子大小，聚集狀態(tài)，綁定和生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，無論是在體外和在體內(nèi)的測定。
FCS - 的方法
FCS是一個(gè)光譜的方法。在這種情況下，“比色皿”是受衍射限制的點(diǎn)（圖1）。因此，使用顯微鏡的原因，是具有高數(shù)值孔徑的透鏡將光束聚焦到一個(gè)femtoliter大小的光斑。一個(gè)可喜的副作用有顯微鏡能夠采取的樣品圖像引用和定位測量點(diǎn)（ROI）。在FCS小學(xué)讀出熒光強(qiáng)度隨時(shí)間（熒光的跟蹤或強(qiáng)度跟蹤）。的熒光的波動(dòng)隱式編碼的粒子數(shù)（即振幅波動(dòng)）和粒子的停留時(shí)間（即頻率的波動(dòng)），見圖2。一個(gè)進(jìn)行自相關(guān)分析，（“自相似性”試驗(yàn)）和曲線擬合，定量地獲得這些參數(shù)（圖3和4）。共聚焦點(diǎn)的激發(fā)和檢測的光的幾何形狀大致如下一個(gè)三維的正態(tài)分布。近似高斯函數(shù)，人們可以找到FCS自相關(guān)函數(shù)的分析模型。它的參數(shù)和它們的物理意義總結(jié)于表1。
圖 1（左）：觀察量和重要的參數(shù)。擴(kuò)散時(shí)間τ D 表示分子觀察量內(nèi)花費(fèi)的時(shí)間，即需要多長時(shí)間橫向擴(kuò)散。的橫向延伸（光束束腰），瓦特 0 ，和軸向延伸部分和z 0 的觀察量（右側(cè)）。他們比? 0/瓦特 0 是偏心率或結(jié)構(gòu)參數(shù)，κ。
圖。2（右）：熒光強(qiáng)度跟蹤。流入和流出的觀察量（上排）的分子的運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度的隨機(jī)波動(dòng)。
圖 3（左）：自相關(guān)原理。熒光跟蹤乘以本身被復(fù)制，并總結(jié)出的結(jié)果。這樣做是為了多次，每次移增量設(shè)定的第二數(shù)據(jù)τ 的（滯后時(shí)間）。小的滯后時(shí)間后，數(shù)據(jù)仍然是自相似的，產(chǎn)生一筆較大（紅色）。更長的轉(zhuǎn)變意味著更小的數(shù)字（綠色和藍(lán)色）。這種技術(shù)通過觀察量的分子擴(kuò)散的頻率分析中的基本信息。 詳細(xì)“解剖”的FCS曲線，即過程的觀察在什么時(shí)間域，以及一般介紹的主題，請參閱佩特拉Schwille和埃爾克·斯特因一篇網(wǎng)上文章 參數(shù) 名 意義 ρ 電流幅度 G（0）振幅貢獻(xiàn)的分子種 τ e 擴(kuò)散時(shí)間 V EFF內(nèi)花費(fèi)時(shí)間分子 τ ? 三胞胎時(shí)間 在黑暗狀態(tài)下度過時(shí)間分子 ? 三聯(lián)分?jǐn)?shù) 在黑暗狀態(tài)下的分子分?jǐn)?shù) κ 結(jié)構(gòu)參數(shù) 的V EFF的偏心率，κ= Z 0 / W 0 表1：三維高斯三重模型數(shù)據(jù)擬合一個(gè)分子物種和正常擴(kuò)散3D參數(shù)。 FCS測量感興趣的是兩個(gè)主要的參數(shù)的擴(kuò)散系數(shù)，τ e，分子的數(shù)目，N.他們直接相關(guān)的擴(kuò)散系數(shù)D，和濃度角分別。然而，無論τ e和N，是由每個(gè)單獨(dú)的儀器和一些實(shí)驗(yàn)參數(shù)的影響的相對數(shù)。取得的*編號(hào)D和c是儀器校準(zhǔn)的目的。 這兩個(gè)參數(shù)，擴(kuò)散時(shí)間和數(shù)目的分子，這取決于觀察量的大小。應(yīng)當(dāng)這里所指的有效容積，V EFF。校準(zhǔn)是確定的V EFF的大小。 三種方法確定V 效率的文獻(xiàn)中描述： 共焦量用熒光珠在3D及裝修的一個(gè)三維高斯函數(shù)的測量。 準(zhǔn)備濃度系列和N作為繪制c的函數(shù)。斜率產(chǎn)生V EFF。 已知的染料與已知的D.曲線擬合產(chǎn)量測量τ e和κ，其中V 效率可以計(jì)算出來。 每種方法都有其缺點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。對于實(shí)施例1。共焦量，給出了一個(gè)確切的描述細(xì)節(jié)以及3D高斯近似持有。這是不測量在水溶液中的實(shí)際測量一樣。第二種方法是modelfree的，V EFF或擴(kuò)散模型的幾何形狀作出任何假設(shè)。因此，它含有沒有關(guān)于它的形狀，它是費(fèi)力，而且可能遭受黑暗的狀態(tài)，如果無科幻擬合曲線被用來估計(jì)N，但它工作在一個(gè)大的濃度范圍內(nèi)。*后一種方法的條件下，非常接近實(shí)際FCS測量，包含了一些信息的幾何形狀的V EFF可以輕松實(shí)現(xiàn)。在下面，我們將研究這一戰(zhàn)略一步一步。所有三種方法進(jìn)行了詳細(xì)的比較。 由于這種方法是基于曲線擬合的結(jié)果，質(zhì)量非常強(qiáng)烈的依賴，對如何做好模型描述了現(xiàn)實(shí)。*強(qiáng)的假設(shè)是一個(gè)三維高斯幾何形狀的V EFF，通常做在FCS分析。因此系統(tǒng)的錯(cuò)位將導(dǎo)致違反了這一假設(shè)。此外，一個(gè)很好的信號(hào)-噪聲比的自相關(guān)是必需的，因?yàn)棣?span id="vi4yemr" class="Apple-converted-space"> e和κ都確定擬合相同的數(shù)據(jù)集。這是*好的滿足明亮，光穩(wěn)定的染料在水中的濃度范圍從0.1納米到10納米[1] 。的有效體積，然后給出在方程1。 公式1：有效容積。觀察體積的大小有關(guān)的FCS測量與瓦特 0 的橫向和z 0 的軸向延伸。這兩個(gè)參數(shù)依賴于τ D 和κ得到的曲線擬合的校準(zhǔn)測量。請注意，這V 有效的是大于2 ^（3/2）?2.8的一個(gè)因素在文獻(xiàn)中通常被稱為共焦體積。
圖。4（右）：自相關(guān)函數(shù)G（τ）被繪制在滯后時(shí)間t。從圖3（紅，綠，藍(lán)點(diǎn)），G（τ 的）代表不同的滯后時(shí)間定性繪制。在G（0）的振幅，編碼的粒子數(shù)N的時(shí)間在半*大振幅（INFL撓度點(diǎn)）產(chǎn)生的逆擴(kuò)散時(shí)間τ D 的，也被稱為為相關(guān)時(shí)間。從這些數(shù)字中，我們可以得到的濃度c和擴(kuò)散系數(shù)D使用適當(dāng)?shù)男?zhǔn)。3D高斯三聯(lián)模型
校準(zhǔn) - 從相對*數(shù)字，
有效體積
校準(zhǔn)策略
通過曲線擬合得到的有效容積
