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大咖講堂 - 相干拉曼散射顯微術(shù)Ⅰ

2020-07-08 10:28:23 奧林巴斯顯微鏡
奧林巴斯顯微鏡

“一花一世界”，這句充滿禪意的話在微觀視野中得到完美詮釋。而構(gòu)成世間萬千紛繁的原子由化學(xué)鍵聯(lián)合為分子，不同的分子往往具有特異性的化學(xué)鍵振動(dòng)，成為它們的指紋特征。相干拉曼散射（Coherent Raman Scattering，CRS）顯微術(shù)便是通過探測(cè)目標(biāo)分子的特征振動(dòng)來提供成像所需的襯度, 同時(shí)基于非線性光學(xué)過程大大增強(qiáng)拉曼散射的信號(hào)，提高成像速率以及檢測(cè)靈敏度的新型顯微技術(shù)[1][2]。

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▲水分子的三種振動(dòng)模式示意


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▲圖 1.水稻花粉的受激拉曼顯微成像圖（紅：脂質(zhì)；綠：淀粉；藍(lán)：蛋白）[3]


常見的光譜學(xué)手段按躍遷類型可分為兩大類：電子光譜和振動(dòng)光譜。電子光譜涉及電子在不同能級(jí)間的躍遷（如吸收光譜和熒光光譜等）；振動(dòng)光譜則作用于化學(xué)鍵或聲子的振動(dòng)（如紅外吸收譜和拉曼散射譜）。如果把電子光譜比作靜如處子但威力強(qiáng)大的內(nèi)功；振動(dòng)光譜則好似動(dòng)如脫兔、招式鮮明的外家拳（見水分子振動(dòng)示意圖）。紅外譜為直接共振吸收，信號(hào)很強(qiáng)但波長(zhǎng)較長(zhǎng)（中遠(yuǎn)紅外），不利于含水環(huán)境的高分辨生物成像；我們通常講的拉曼散射指自發(fā)拉曼散射過程，信號(hào)非常弱（比熒光低 8-10 個(gè)數(shù)量級(jí)），無法用于快速成像。相干拉曼是增強(qiáng)拉曼的手段之一，利用短脈沖激光的非線性效應(yīng)實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。

簡(jiǎn)單概括，相干拉曼散射顯微術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：

  1. 免標(biāo)記和分子特異性：CRS 成像的信號(hào)來源于目標(biāo)分子本身，無需外源標(biāo)記物，也避開了藥物小分子等不易標(biāo)記的問題，在活體（in vivo）觀測(cè)上更具有優(yōu)勢(shì)；可對(duì)具有不同拉曼譜的分子進(jìn)行選擇性成像，比如生物樣品里常見的脂質(zhì)、蛋白、核酸和糖類等（如圖 1）；

  2. 較高的探測(cè)靈敏度：相比于自發(fā)拉曼，成像速度一般有 3-5 個(gè)數(shù)量級(jí)的提升，一定條件下可實(shí)現(xiàn)視頻成像速度（每秒幾十幀）；

  3. 光學(xué)層析和三維掃描：類似多光子顯微鏡的光學(xué)層析和三維成像功能；且由于所用的激發(fā)波長(zhǎng)一般在近紅外，有較好的穿透深度和更小的光毒性。


根據(jù)非線性光學(xué)過程的不同，可將相干拉曼散射分為兩種：相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering，CARS）和受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）。雖然這兩種非線性光學(xué)現(xiàn)象很早就被發(fā)現(xiàn)（上世紀(jì) 60 年代），但長(zhǎng)期僅作為光譜學(xué)測(cè)量手段，直到 1999 年以及 2008 年，哈佛大學(xué)謝曉亮教授才分別將它們以實(shí)用顯微成像技術(shù)推廣開來[4][5]。


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▲圖 2. 自發(fā)拉曼散射、受激拉曼散射以及相干反斯托克斯拉曼散射的能級(jí)示意圖


自發(fā)與相干拉曼散射的能級(jí)示意圖見圖 2。自發(fā)拉曼只需要一束激發(fā)光，稱為泵浦光（ωp），泵浦光子與分子發(fā)生非彈性碰撞，將部分能量轉(zhuǎn)移給分子振動(dòng)。因此散射出來的光相對(duì)于泵浦光將發(fā)生一系列的頻率紅移，稱為斯托克斯光（ωs），對(duì)應(yīng)到光譜儀中的一系列譜峰，成為該分子的指紋特征。泵浦和斯托克斯光子的頻率差正好共振于化學(xué)鍵的振動(dòng)頻率（Ω=ωp-ωs），滿足能量守恒。對(duì)于相干拉曼散射，需將泵浦和斯托克斯這兩束激光同時(shí)作用于分子，當(dāng)它們的頻率差（拍頻）共振于某個(gè)化學(xué)鍵的振動(dòng)時(shí)，大量分子的同一個(gè)振動(dòng)模式將被同步（相干地）激發(fā)起來，使得散射效率得到大大地增強(qiáng)。最終表現(xiàn)為：泵浦光減弱（受激拉曼損失，SRL）、斯托克斯光增強(qiáng)（受激拉曼增益，SRG），并且出現(xiàn)反斯托克斯（ωas=2ωp-ωs）的新頻率分量（CARS）。自發(fā)拉曼散射與熒光、吸收等同屬線性光學(xué)范疇，一般使用連續(xù)激光即可。相干拉曼與雙光子熒光、二次諧波等都屬非線性光學(xué)范疇，需使用超短脈沖激光。最常見的用于相干拉曼的光源是皮秒光參量振蕩器（OPO），輸出兩路皮秒光，一束波長(zhǎng)固定（如 1064nm），另一束波長(zhǎng)在近紅外區(qū)間可調(diào)，它們分別作為斯托克斯和泵浦光。調(diào)節(jié)激光波長(zhǎng)使得我們可以改變待測(cè)拉曼頻率，選擇性地去探測(cè)不同的化學(xué)鍵/分子。
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CARS 與 SRS 雖然都是三階非線性光學(xué)過程，它們之間有明顯的區(qū)別：CARS 是個(gè)四波混頻過程，產(chǎn)生的光子具有第三種頻率——反斯托克斯光子 ωas，因此只需采用合適的濾波片就可以簡(jiǎn)單地提取出來；而 SRS 是泵浦和斯托克斯光之間的相互轉(zhuǎn)化過程，泵浦光子的湮滅和斯托克斯光子的產(chǎn)生同時(shí)發(fā)生，但沒有產(chǎn)生第三種光子；因此，通常用泵浦-探測(cè)技術(shù)中常見的調(diào)制解調(diào)的方式來提取信號(hào)，需要借助鎖相放大器來實(shí)現(xiàn)。CARS 顯微成像技術(shù)自 1999 年被發(fā)明以來，一直受困于非共振背景信號(hào)的干擾，典型的表現(xiàn)為光譜發(fā)生畸變（圖 3）。在苦苦求索了近 10 年之后，謝教授課題組于 2008 年推出了 SRS 技術(shù)，完美地解決了上述問題。CARS 過程中能量被封鎖于電磁場(chǎng)/光子中，電子躍遷可繞過分子振動(dòng)直接通過虛能級(jí)產(chǎn)生；而 SRS 的發(fā)生依賴于光子能量與分子振動(dòng)之間的交換，具有嚴(yán)格的共振吸收特征。因此 SRS 在光譜上與自發(fā)拉曼一致（圖 3），在圖像上也不再受非共振背景的困擾（圖 4）。此外，SRS 的信號(hào)與分子濃度呈線性關(guān)系，更方便于定量解析復(fù)雜混合物體系中的各種化學(xué)成分。也因?yàn)檫@些特性，SRS 不斷獲得研究者們的青睞。

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▲圖 3. 視黃醇在 1595cm-1處的 Raman、CARS 與 SRS 的光譜對(duì)比 [5]


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▲圖 4. CARS 與 SRS 對(duì)線蟲內(nèi)脂質(zhì)成像 [6]


綜上，CARS 與 SRS 都可以基于生物體中核酸、脂質(zhì)和蛋白等物質(zhì)自身的 Amide I、CH2、CH3 等化學(xué)鍵進(jìn)行特異性成像。由于其免標(biāo)記、高分辨率、快速成像以及三維掃描的優(yōu)點(diǎn)，CRS 在病理檢測(cè)、生物代謝、藥物運(yùn)輸等方面具有廣泛應(yīng)用。具體的應(yīng)用部分將在下一課堂詳細(xì)講解。




下面讓我們先開啟幾個(gè) CRS 的成像結(jié)果

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▲圖 5. SRS 對(duì) Hela 細(xì)胞中的核酸、蛋白和脂質(zhì)進(jìn)行選擇性成像 [7]


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▲圖 6. 小鼠腦腫瘤模型的受激拉曼成像。活體實(shí)驗(yàn)中，在（a）肉眼無法分辨腫瘤的區(qū)域；（b）受激拉曼技術(shù)可以清晰的探測(cè)到腫瘤邊界；（c）離體鼠腦切片的 SRS 圖像。藍(lán)色代表蛋白豐富的腫瘤區(qū)域 [8]


 

▲視頻 1.CARS 對(duì)皮膚癌囊塊的三維層析掃描


 

▲視頻 2.SRS 觀察小鼠耳下血管內(nèi)紅細(xì)胞的流動(dòng)


 

▲視頻 3.SRS 觀察視黃醇在小鼠耳朵皮膚上的滲透過程



參考文獻(xiàn)：

1.Alfonso-Garcia, A., Mittal, R., Lee, E. S. & Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. J Biomed Opt 19, 71407,

doi:10.1117/1.JBO.19.7.071407 (2014)


2.Cheng, J. X. & Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science350,aaa8870,

doi:10.1126/science.aaa8870 (2015).


3.He, R. et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica 4,

doi:10.1364/optica.4.000044 (2016).


4.Zumbusch, A., Holtom, G. R. & Xie, X. S. Three-Dimensional Vibrational Imaging by Coherent Anti-Stokes Raman Scattering. Physical Review Letters 82, 4142-4145,

doi:10.1103/PhysRevLett.82.4142 (1999).


5.Freudiger, C. W. et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.Science 322, 1857-1861,

doi:10.1126/science.1165758 (2008).


6.Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G. & Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy.Nat Methods 8, 135-138,

doi:10.1038/nmeth.1556 (2011).


7.Lu et al., Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 112, E5902,

doi:10.1073/pnas.1515121112 (2015).


8.Ji, M. et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy.Science translational medicine 5, 201ra119,

doi:10.1126/scitranslmed.3005954 (2013).

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作者簡(jiǎn)介

季敏標(biāo)，男，1982 年出生于浙江省臺(tái)州市。2001 年獲北京大學(xué)物理系學(xué)士；2011 年獲美國(guó)斯坦福大學(xué)物理系博士學(xué)位，研究方向?yàn)榉蔷€性光學(xué)和超快分子動(dòng)力學(xué)；之后在哈佛大學(xué)謝曉亮組里從事博士后研究（2011-2014），發(fā)展相干拉曼成像技術(shù)并將其應(yīng)用到腫瘤的無標(biāo)記探測(cè)。2014 年入職復(fù)旦大學(xué)物理系擔(dān)任研究員和博士生導(dǎo)師。2015 年入選中組部“千人計(jì)劃”（青年組）和上海市“青年科技啟明星計(jì)劃”。


季教授的研究方向集中在非線性光譜學(xué)在物理、化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等交叉學(xué)科中的應(yīng)用，研究課題包括利用新型光譜顯微成像技術(shù)研究生物醫(yī)學(xué)問題，以及新材料的光電子特性研究等。迄今發(fā)表 SCI 論文 50 余篇，包括 Science, Science Translational Medicine, Science Advances, PNAS 等。并承擔(dān)科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“數(shù)字診療裝備”青年專項(xiàng)、基金委面上項(xiàng)目、上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃等多項(xiàng)科研項(xiàng)目。



作為一款成熟的商品化 CRS 產(chǎn)品，徠卡 TCS SP8 CARS 共聚焦顯微鏡可以簡(jiǎn)單快速地實(shí)現(xiàn) CARS 無標(biāo)記成像、單光子/多光子共聚焦熒光成像、二次（SHG）/三次（THG）諧波成像，或者使用紅外、紫外激光進(jìn)行的各種應(yīng)用的成像，滿足全方位、多維度的高級(jí)生命科學(xué)研究需要。

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