尼康顯微鏡三色帶通激發(fā)塊

包括在尼康三色波段激發(fā)熒光激發(fā)塊組合是兩個各自包含三個帶通發(fā)射區(qū)能夠通過藍(lán)色，綠色，黃色，橙色的窄波段，和紅光譜區(qū)有選擇地分離出熒光發(fā)射小心平衡組合。 此交互式教程探索的變化而激發(fā)和發(fā)射激發(fā)塊的光譜分布，以及那些的多色鏡子，如何影響在設(shè)計用于乘法標(biāo)記的熒光團(tuán)在三色激發(fā)組合信號電平，光譜交叉，整體過濾性能，并且圖像對比度紫外線，藍(lán)色和綠色區(qū)域。

教程初始化與隨機(jī)選擇的熒光檢體中出現(xiàn)的標(biāo)本圖像窗口和紫外線藍(lán)綠三帶通激發(fā)塊激發(fā)組合（DAPI-FITC-TRITC;默認(rèn)）上的過濾器集譜概況圖形顯示頻譜輪廓。 熒光的吸收和發(fā)射光譜截面（帶過濾器的傳輸通帶重疊區(qū)域）可以選擇在光譜截面標(biāo)題中列出相應(yīng)的復(fù)選框（ 吸收或發(fā)射 ）單獨或集體觀看。 當(dāng)一個或多個復(fù)選框被激活，將合并的過濾器的透射和反射光譜疊加在所選擇的熒光團(tuán)（多個）使用以標(biāo)記樣品（熒光光譜圖中不包括對自身熒光植物標(biāo)本）的吸收光譜和發(fā)射光譜。 熒光團(tuán)的吸收光譜示于使用棕色填充的教程，而相應(yīng)的發(fā)射光譜表示用灰色填充。 由過濾器設(shè)置滑塊顯示過濾器組合波長特性，顯示在本教程中下部的黑色方形框。 這些值被不斷地更新作為滑塊被翻譯從左至右。

為了操作教程，使用過濾器設(shè)置滑塊可供三頻激發(fā)兩個過濾器組合之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換。 當(dāng)滑塊從左至右翻譯，激發(fā)和阻擋濾光片的光譜分布，以及該多色鏡，被修飾以模擬變化的光譜分布。需要注意的是連續(xù)變化的光譜圖并不暗示任何激發(fā)塊的組合是可能的，也不是單獨的過濾器設(shè)置可變（沒有物理地更換過濾器）的問候的光譜分布。 的選定的過濾器套之間的頻譜輪廓的變化被簡單地用于幫助建立在每個光學(xué)塊中使用的過濾器的組合之間的關(guān)系。

個別過濾光譜 （激發(fā)，發(fā)射和多色反光鏡）可以通過選擇或取消相應(yīng)的復(fù)選框的下面圖中添加或刪除過濾器設(shè)置光譜曲線圖。 此外，該熒光團(tuán)的吸收光譜和發(fā)射光譜可以被添加或與一組類似的復(fù)選框（ 頻譜截面 ）除去。 檢體圖像同時改變與過濾器配置文件以反映變化由改變通過所述滑塊的平移產(chǎn)生的過濾器的組合產(chǎn)生的對比度和信號電平。 新的標(biāo)本可以在任何時候選擇使用選擇的樣本下拉菜單，用來標(biāo)記選定樣本的熒光直接列出的菜單框的下方。 在所有的情況下，將樣品粘有兩個或更多熒光探針展示熒光的具有窄的和寬的通帶阻（發(fā)射）過濾套的選擇性分離。

尼康顯微鏡三色波段熒光集被主要設(shè)計用于與特定的三熒光套件最佳性能，盡管它們都同樣有效用具有類似的吸收和發(fā)射光譜曲線候補(bǔ)探針組合。 利用精確的波段選擇，具有反射和透射區(qū)之間的陡峭的帶通轉(zhuǎn)換，多重激發(fā)和發(fā)射信號分離以最小的干擾。 為了保持三個單獨的熒光信號波段，這些專門的過濾器組還包含二色鏡具有多個帶通特性，其具有互補(bǔ)于所采用的具體的激發(fā)和發(fā)射激發(fā)塊的傳輸和反射區(qū)域。 每個尼康三波段熒光集優(yōu)化結(jié)合DAPI和FITC（異硫氰酸熒光素）與使用或者TRITC（異硫氰酸四甲），或得克薩斯州紅探頭。 對應(yīng)于這些熒光染料的組合相關(guān)的頻譜區(qū)的范圍從紫色激發(fā)和發(fā)射藍(lán)色到綠色的激發(fā)和紅色發(fā)光。

尼康DAPI-FITC-TRITC三色波段激發(fā)塊組合結(jié)合有一個通帶為紫色區(qū)域的激發(fā)（385?400納米），連接到一個帶通發(fā)射（屏障）過濾器發(fā)射藍(lán)色熒光（450到465納米）在其第一激發(fā)濾光片（最短波長）信號帶。 第二個激發(fā) - 發(fā)射波長組合，此過濾器集允許藍(lán)色激發(fā)在475至490納米的窄帶和檢測所產(chǎn)生的綠色熒光，在505至535納米范圍內(nèi)。 第三熒光信號由綠色區(qū)域激發(fā)（545至565納米），其導(dǎo)致橙紅色發(fā)光，在580至620納米的波長范圍內(nèi)檢測產(chǎn)生的。這套三聯(lián)熒光帶提供最佳的同時檢測DAPI，F(xiàn)ITC和TRITC，專門針對不同的細(xì)胞成分; DAPI - Alexa Fluor 488 - MitoTracker Red CMXRos熒光組合是適合這個過濾器設(shè)置為好，該Alexa Fluor 488和MitoTracker Red CMXRos光譜曲線那些FITC和TRITC的相似性。

在三色激發(fā)激發(fā)塊塊，與在其他的多波段套，二色反射鏡的設(shè)計是至關(guān)重要的多個熒光信號的分離，允許其檢測具有最小交叉（光譜bleedthrough）和噪音。 與此相反的長通分光鏡常常在傳統(tǒng)的過濾器組合使用時，多波段套采用二色反射鏡與被精確地定位相對于所述多個激發(fā)和發(fā)射波段的帶通數(shù)的區(qū)域。 典型地，第一（下部）切割上的反射鏡被定位僅僅幾納米上述短波長激發(fā)峰，開始一個傳輸波段完全圍繞相應(yīng)的發(fā)光峰值波長的值，接著是陡峭的透射截止，這允許第二激發(fā)帶的反射。 在剛剛比第二激發(fā)帶更高的指定波長，反射鏡使另一個尖銳過渡到與所述第二發(fā)射帶通相對應(yīng)的發(fā)送區(qū)域。 在三頻段激發(fā)塊組，該發(fā)送反射圖案被重復(fù)一次的第三信號通道。 在DAPI-FITC-TRITC組合使用二色鏡具有適當(dāng)?shù)匚挥谙鄬τ诟鱾€激發(fā)和發(fā)射激發(fā)塊互補(bǔ)的多個帶通透射區(qū)域。 切的波長出現(xiàn)在435，500，和570納米。（奧林巴斯顯微鏡）

薄膜干涉技術(shù)中的多波段激發(fā)塊組的制造中的應(yīng)用使得有可能平衡的兩個（或更多）的熒光染料，以提供最佳的成像特性的熒光信號水平。 在許多過濾器的組合，所述短波長激發(fā)峰的傳輸特性文件的尺寸減小，以平衡兩個或三個發(fā)射信號，以及以最小化光漂白和標(biāo)本的損傷。這是在套設(shè)計用于與一種熒光團(tuán)激發(fā)的紫光或紫外光譜區(qū)，使用特別重要的是由于較短的波長的高激發(fā)效率。 短波長激發(fā)峰的顯著降低強(qiáng)度示于兩個尼康三頻組合的透射光譜。 它也可以注意到通過檢查某些部件是通用的，以一個以上的過濾器塊中的過濾器組透射光譜。 例如，雙波段FITC-Texas Red和三色波段DAPI-FITC-Texas Red套利用相同的二色鏡和發(fā)射濾光片，只是在不同的激發(fā)激發(fā)塊組件，其中第三個短波通帶被添加為DAPI激發(fā)在三聯(lián)集。

同時檢測DAPI，F(xiàn)ITC和德克薩斯紅（或類似的光譜熒光團(tuán)），可以很容易地實現(xiàn)與尼康DAPI-FITC-Texas Red三色激發(fā)帶通激發(fā)塊組合。 紫色激，藍(lán)色發(fā)射激發(fā)塊波段，和藍(lán)色激發(fā)綠色發(fā)射帶（對應(yīng)于DAPI和FITC，分別）具有類似的特性對于與DAPI-FITC-TRITC集，雖然有輕微的修改與更好的集成德克薩斯紅，綠的激發(fā)的紅色發(fā)光的光譜特性發(fā)生在較高波長相比TRITC。 在這一組中使用的激發(fā)濾光片具有395至410納米（紫色激發(fā)）聯(lián)接到450至470納米的發(fā)射（阻擋）激發(fā)塊的通帶（藍(lán)色發(fā)光），這是適合于DAPI和類似的熒光團(tuán)1帶通區(qū)域。激發(fā)塊組的第二波段提供激發(fā)在490至505納米的藍(lán)色波長范圍內(nèi)，并且檢測在515和545納米之間的范圍中相應(yīng)的綠色發(fā)光的（用于FITC和類似的熒光染料）。 對于德克薩斯紅熒光優(yōu)化信道具有560至580納米（綠色激發(fā)），耦合到一個發(fā)射帶在600至650納米的紅色光譜區(qū)域中的激發(fā)范圍。

奧林巴斯顯微鏡雖然對于DAPI，F(xiàn)ITC和德克薩斯紅熒光團(tuán)的三色聯(lián)合優(yōu)化，探針具有相似的吸收和發(fā)射光譜特性也可以使用與此過濾器集。 相比，DAPI-FITC-Texas Red塊，產(chǎn)生出現(xiàn)更多的橙******調(diào)圖像中的DAPI-FITC-TRITC塊，其中有一個紅色發(fā)射通帶錯開15納米到較低的波長。 該二色鏡（分束器），在DAPI-FITC-Texas Red濾光片組合的帶通區(qū)域的戰(zhàn)略位置處的445，510，和590納米的截止點的波長與激發(fā)和發(fā)射激發(fā)塊窗口來對應(yīng)。 規(guī)格為二色鏡和濾光片的兩個尼康三色波段激發(fā)塊的組合列于表1。

• DAPI-FITC-TRITC -的DAPI-FITC-TRITC激發(fā)塊組合被設(shè)計成用于同時從具有類似的光譜特性的熒光染料DAPI，F(xiàn)ITC和TRITC或其他探針組合檢測發(fā)射。 三個狹窄的激發(fā)和發(fā)射譜帶對應(yīng)紫色激發(fā)特定區(qū)域與相應(yīng)的橙紅色發(fā)光藍(lán)色發(fā)光，藍(lán)色激發(fā)耦合到綠色排放，綠色激發(fā)。

• DAPI-FITC-Texas Red -時相比，標(biāo)準(zhǔn)的DAPI-FITC-TRITC集綠色發(fā)射， -該DAPI-FITC-Texas Red濾光片組合的設(shè)計稍有不同的通帶區(qū)域為紫色激發(fā)-藍(lán)色發(fā)射，以及用于藍(lán)色激發(fā)。 這種設(shè)計是為了更好地與必要的得克薩斯紅更高的激發(fā)和發(fā)射波長，相對于對于TRITC的值符合。 多帶通地區(qū)的用戶提供最佳的檢測，以最小的交叉和噪音，為DAPI，F(xiàn)ITC同時可視化和德克薩斯紅，或類似的光譜熒光組合。