霍夫曼調(diào)制對(duì)比已經(jīng)確立了自己作為觀察未染色，低對(duì)比度生物標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)。其創(chuàng)新的技術(shù)實(shí)施許可顯著簡(jiǎn)單的處理和更大的靈活性。在現(xiàn)代倒置顯微鏡的光路調(diào)制器的集成允許使用范圍廣泛的明場(chǎng)或載物臺(tái)的物鏡，而不是一小部分的特殊物鏡。現(xiàn)在，對(duì)比度可以修改和優(yōu)化的單獨(dú)使用自由接近調(diào)制器。

調(diào)節(jié)對(duì)比度

調(diào)節(jié)對(duì)比度是對(duì)比度增強(qiáng)的寬視場(chǎng)顯微鏡可以轉(zhuǎn)換在未染色標(biāo)本和活細(xì)胞光學(xué)梯度或斜坡入不同的光強(qiáng)度的方法。它是在1975年發(fā)明了由羅伯特·霍夫曼和采用狹縫板，使斜照明和調(diào)制器，用于光強(qiáng)度調(diào)制。由于樣品的三維外觀，在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的調(diào)節(jié)對(duì)比度的主要應(yīng)用是類似ICSI和顯微技術(shù)（胞漿內(nèi)單精子注射）在IVF克隆和原核注射轉(zhuǎn)基因。

在光路徑中的特殊成分

在光路中的至少兩個(gè)特殊的部件所必需的調(diào)節(jié)對(duì)比度的照明。以使斜光的狹縫板放置在聚光鏡的前焦平面。其次，調(diào)制器被放置在物鏡的后焦平面。調(diào)制器包含具有不同的光密度三個(gè)指定區(qū)域：一個(gè)透明區(qū)，一個(gè)具有15％的光的權(quán)限和一個(gè)用1％的光的權(quán)限。光通過(guò)調(diào)制器是通過(guò)定義所謂的調(diào)制。

除了上述組分含有偏振片的第二狹縫通?？梢栽诨瑒?dòng)板中找到。在與位于顯微鏡的聚光鏡的頂部，另一個(gè)偏振片組合，該偏振片可以用于控制有效狹縫開口（通過(guò)打開90°（暗）的位置），并啟用緩解的效果。需要注意的是檢體未允許的雙折射塑料或玻璃容器雇傭的偏振器之間的位置。然而，偏振片不是調(diào)制對(duì)比度的先決條件。

圖1：從聚光鏡光通過(guò)該狹縫板的狹縫，以使偏斜照明。當(dāng)光通過(guò)樣品，這是在相變偏轉(zhuǎn)（例如改變細(xì)胞膜的斜率）。隨后，光被偏轉(zhuǎn)到調(diào)制器產(chǎn)生一個(gè)浮雕狀，三維圖像的印象的不透明或透明的部件。 

圖2：當(dāng)光通過(guò)它被調(diào)制在幅度調(diào)制器的不同區(qū)域。通常該區(qū)域具有（左到右）的1％，15％或100％的傳輸。

調(diào)制相差梯度轉(zhuǎn)換成亮度漸變

細(xì)胞的許多部件導(dǎo)致通過(guò)固有特性的改變透射光的相位。這些性能可能是斜率和特定結(jié)構(gòu)的陡度，獲得修改折射率變化率或僅僅改變?cè)诮o定結(jié)構(gòu)的厚度的結(jié)構(gòu)。由于這些性質(zhì)（如單元厚度）通常在一定面積逐漸變化（而不是立即改變），光的相位的過(guò)這方面的變化也發(fā)生逐漸導(dǎo)致相位梯度。相梯度將衍射入射光引起的光的偏轉(zhuǎn)角的變化。

由于所采用的調(diào)制相反的偏斜照明，在偏轉(zhuǎn)的角度的變化可能大大受到影響，光將通過(guò)調(diào)制器在不同的區(qū)域相比，非偏轉(zhuǎn)的光。在小區(qū)（s）表示，都或多或少均勻的斜率，陡度，厚度等的圈所產(chǎn)生的圖像的區(qū)域?qū)@示為灰色。同樣情況也適用于圖象的背景，因?yàn)楣馔ㄟ^(guò)這些同質(zhì)區(qū)域不會(huì)經(jīng)歷相移由于在檢體相梯度和幾乎不被偏轉(zhuǎn)。（奧林巴斯顯微鏡）

在一個(gè)調(diào)制對(duì)比度系統(tǒng)的非偏轉(zhuǎn)的光通過(guò)在用15％的光的權(quán)限的調(diào)制器的面積，導(dǎo)致灰的顏色為細(xì)胞（S）和背景的均質(zhì)區(qū)域。當(dāng)光通過(guò)引起的相移（例如改變細(xì)胞膜的斜率）的試樣的區(qū)域中，光被偏轉(zhuǎn)或者黑暗（1％許可）或調(diào)制器的透明（100％許可）的區(qū)域。作為試件是傾斜地照亮，該圖像將出現(xiàn)從梯度從梯度的另一側(cè)（在光被偏轉(zhuǎn)到區(qū)域與（其中光被偏轉(zhuǎn)到區(qū)域用1％許可）和亮的一側(cè)較深100％的許可）。

圖3A，B：通過(guò)將相梯度為亮度梯度調(diào)節(jié)對(duì)比度可視化的透明，低對(duì)比度的標(biāo)本。其結(jié)果是，高對(duì)比度的灰度級(jí)形成的創(chuàng)建三維圖像的印象。（圖3a禮貌C. Mehnert的，體外授精中心，德國(guó)吉森）

IMC提供了更多的自由

在綜合調(diào)制對(duì)比度的情況下（IMC）的調(diào)制器的物鏡以外的焦平面共軛到所述聚光鏡（中間光瞳）的光束路徑（圖4）結(jié)合起來(lái)。調(diào)制器被安裝在其上分別插入在支架上（圖5）一側(cè)的瞳孔間接口滑塊。因此，它們是自由訪問(wèn)，并允許用戶根據(jù)需要很容易地調(diào)節(jié)對(duì)比度。 除此之外，也可以使用調(diào)制器，具有不同的傳輸?；瑝K還設(shè)有用于調(diào)制的圖像的位置明。用顯微鏡法團(tuán)校董會(huì)已成立，以確保對(duì)比度（3D印象的影子方向）的方向是相同的所有物鏡。 檢體的空間印象改變物鏡或放大倍數(shù)時(shí)因而保持不變，因此沒(méi)有必要調(diào)整狹縫狀光闌。

圖4：在徠卡的數(shù)碼倒置顯微鏡IMC解決方案。該調(diào)制器可自由在中間光瞳為靈活調(diào)整物鏡外部訪問(wèn)和定位的。狹縫狀光闌定位在聚光鏡瞳孔。

圖5：IMC滑塊與在兩個(gè)不同的光瞳位置調(diào)制器的光盤是容易使用，并允許單獨(dú)調(diào)整。

脫開的調(diào)制器時(shí)的一個(gè)基本的考慮是，在物鏡的后焦平面可以是45毫米齊焦距離的整個(gè)范圍內(nèi)的任何地方。因此，物鏡的外部的調(diào)制器必須是可移動(dòng)的至少該距離。多虧的徠卡物鏡，這是由固定焦平面，部署在倒置顯微鏡和固定倍率步驟從5倍定義為63X的設(shè)計(jì)，有可能減少調(diào)制平面數(shù)兩個(gè)瞳孔的位置（圖6）。

光束路徑的瞳孔，在所謂的中間光瞳的圖像，被設(shè)計(jì)成一個(gè)1×望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)。物鏡背后的無(wú)限光路轉(zhuǎn)載于中間的瞳孔。其結(jié)果是，平面平行的光的任何厚度的調(diào)節(jié)劑，也可以插入到在中間光瞳的光束路徑，傾斜或未傾斜，而不損害圖像的位置或質(zhì)量。雜散和虛光由望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)的*優(yōu)單色和彩色校正以及IMC調(diào)制器的汽相淀積灰色和暗金屬涂層的極低反射特性*小化。

圖6：徠卡物鏡是通過(guò)固定的焦平面定義。由于它們?cè)诘怪蔑@微鏡和由于固定倍率步驟五倍63X的使用，有可能減少調(diào)制平面數(shù)兩個(gè)瞳孔的位置。

獨(dú)立可變參數(shù)

法團(tuán)校董會(huì)提供充足的空間用于調(diào)制對(duì)比度個(gè)別調(diào)整。該調(diào)制器是垂直可調(diào)，以提供均勻的圖像在任何時(shí)候。不同階段或緩沖溶液的水平，并在檢體盤的細(xì)胞的不同位置因此可以補(bǔ)償。移動(dòng)調(diào)制器橫盤改變分辨率：進(jìn)一步調(diào)制器和狹縫隔膜向外移動(dòng)，更高的分辨率（*大分辨率RES =λ 2NA）。

兩個(gè)調(diào)制器參數(shù)影響的對(duì)比度的強(qiáng)度：發(fā)送和灰色區(qū)的寬度。 降低傳輸增加對(duì)比度。 的25％的傳輸，例如，導(dǎo)致在光滑對(duì)比度。 具有大約10％的值時(shí)，對(duì)比度變顯著更清晰。 改變調(diào)制器的寬度也同樣有效（圖7）。

圖7：橫向可調(diào)調(diào)制器可變分辨率，裂隙隔膜額外的極化狹縫可調(diào)的浮雕效果。

縮小灰色區(qū)域的結(jié)果更清晰的對(duì)比，而寬調(diào)制器柔化整體形象的印象。法團(tuán)校董會(huì)的狹縫隔膜有兩個(gè)開口。*狹縫上成像的調(diào)制器的灰色區(qū)域，產(chǎn)生用于調(diào)制對(duì)比度的偏斜照明。 第二狹縫覆蓋有偏振箔（圖7）?？尚D(zhuǎn)的偏振器定位在膜片的前面可以增加或減少的調(diào)制對(duì)比度3D效果。 用塑料盤工作時(shí)，由于光只偏振光在照明側(cè)并沒(méi)有分析器上使用物鏡側(cè)偏振片不影響圖像質(zhì)量。狹縫隔膜的尺寸相匹配的*常用的聚光鏡。

因此IMC不僅適用于生物材料的常規(guī)檢查 - 這也是一個(gè)很好的工具，為要求苛刻的應(yīng)用，如顯微操作，顯微注射或顯微解剖。

IMC的優(yōu)點(diǎn)

眾多優(yōu)勢(shì)使綜合調(diào)節(jié)對(duì)比度的寬視場(chǎng)顯微鏡一個(gè)廣泛使用的方法。 綜合調(diào)節(jié)對(duì)比度可與放大倍數(shù)高達(dá)63X的物鏡使用。不需要特殊的物鏡，并具有較高的校正（如平場(chǎng)消色差和復(fù)消色差物鏡）的物鏡可以用于調(diào)制對(duì)比度。這使得*的具有良好的對(duì)比度和細(xì)節(jié)的可視性解決

調(diào)節(jié)對(duì)比度顯微鏡觀察的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，不像在微分干涉顯微鏡，塑料器皿和培養(yǎng)皿器具可以使用，如在光路中的偏振器位于所述樣品之前。此外不需要沃拉斯頓棱鏡。這導(dǎo)致對(duì)裝有調(diào)節(jié)對(duì)比度顯微鏡適中的成本。