蓋玻片

載玻片上的大多數(shù)生物標(biāo)本都被蓋玻片保護(hù)。這意味著來(lái)自標(biāo)本的光必須總是穿過(guò)玻璃罩，使得這塊薄的玻璃片成為顯微鏡工藝的重要組成部分。

日本制造的蓋玻片規(guī)格由日本工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（JIS）確定。以下是具體光學(xué)興趣的一個(gè)例子：

• 折射率：

  No.1

• 阿貝數(shù)：

  υ= 56±2

• 平整度：

  0.010mm

• 厚度：

  名稱(chēng)：No.1，厚度范圍：0.12-0.17 
  名稱(chēng)：No.1-S，厚度范圍：0.15-0.18

所以我們看到蓋玻片根據(jù)嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)制造，這也決定了物鏡的設(shè)計(jì)（通常為0.17毫米厚）。正確使用顯微鏡的*步是使用符合這些標(biāo)準(zhǔn)的蓋玻片。

覆蓋玻片和球面像差

為什么有必要設(shè)計(jì)一個(gè)符合保護(hù)標(biāo)本的蓋玻片標(biāo)準(zhǔn)的物鏡？

例如，如果你要把一塊玻璃放在一些東西上，通?？雌饋?lái)不會(huì)很明顯，而不是稍微靠近一點(diǎn)。這是因?yàn)閺膶?duì)象朝向觀察者的眼睛（也稱(chēng)為光學(xué)術(shù)語(yǔ)的數(shù)值孔徑）的單一光線的角度非常小。換句話說(shuō)，如果數(shù)值孔徑小，則覆蓋層將不會(huì)顯著影響物體的出現(xiàn)。

然而，如果數(shù)值孔徑較大，例如在物鏡的情況下，則甚至薄的覆蓋層將對(duì)圖像質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。其主要原因是稱(chēng)為“球面像差”。

如圖1所示，當(dāng)光線L0-L3在覆蓋玻片下從物體P彈起時(shí)，它們?cè)谶M(jìn)入物鏡之前都被折疊在蓋玻片內(nèi)。從物鏡的角度來(lái)看，似乎每個(gè)這些光線都來(lái)自不同的點(diǎn)。即使是具有*小數(shù)值孔徑的L0，看起來(lái)好像是來(lái)自P以外的點(diǎn)。這就是為什么玻璃上的物體看起來(lái)更接近肉眼，其深度P0等于厚度（d）除以折射率（n）。偏離此位置變?yōu)榍蛎嫦癫睢?/span>

當(dāng)數(shù)值孔徑相對(duì)較小時(shí)，如光線L1，與P0點(diǎn)的偏差較小。然而，隨著數(shù)值孔徑的增加，球面像差也增加。這就是為什么在設(shè)計(jì)具有更大數(shù)值孔徑的生物學(xué)物鏡時(shí)需要考慮覆蓋玻片球面像差的像差設(shè)計(jì)。

校正環(huán)

生物樣本的物鏡通常設(shè)計(jì)為0.17毫米厚的覆蓋層。然而，如上所述，即使根據(jù)顯微鏡規(guī)格設(shè)計(jì)的覆蓋層也可以具有在0.12-0.18mm之間的厚度變化。

覆蓋玻片產(chǎn)生的球面像差隨著覆蓋層厚度的增加而增加，因此厚度大于0.17 mm的厚度將*出大多數(shù)物鏡的修正。然而，這并不意味著更薄的總是更好。由于物鏡被設(shè)計(jì)為補(bǔ)償0.17mm覆蓋玻片的球面像差，所以太薄的覆蓋玻片也將引起球面像差。因此，比設(shè)計(jì)的物鏡更薄或更厚的覆蓋玻片將引起球面像差。

圖2說(shuō)明了覆蓋層厚度的偏差如何影響圖像質(zhì)量。橫軸表示覆蓋玻片厚度偏差，而垂直軸顯示圖像退化量作為點(diǎn)擴(kuò)散功能，其中理想圖像為1.圖表顯示，即使使用與數(shù)值孔徑相同的蓋玻片偏差，圖像質(zhì)量也會(huì)很大。例如，在數(shù)值孔徑為0.95的情況下，即使0.01mm的厚度偏差，導(dǎo)致圖像從理想值降低了一半。然而，0.4的數(shù)值孔徑對(duì)于具有0.01mm相同厚度偏差的圖像幾乎不施加影響。

圖3顯示了通過(guò)具有適當(dāng)覆蓋玻片（A）的數(shù)值孔徑0.95的物鏡和具有厚度偏差（B）的覆蓋玻片觀察到的相同物體的顯微鏡圖像。后一種形象的焦點(diǎn)和對(duì)比度都較差。

 

圖3.圖像質(zhì)量與正確或不正確的覆蓋層玻璃的比較

為了獲得具有高數(shù)值孔徑的理想圖像，必須非常精確地測(cè)量覆蓋層厚度，并選擇合適的厚度。然而，這在實(shí)踐中很難實(shí)現(xiàn)。這就是為什么幾乎所有具有高數(shù)值孔徑的物鏡都具有內(nèi)置的稱(chēng)為校正環(huán)的機(jī)構(gòu)。

校正環(huán)是連接到物鏡的一塊圓形金屬。通過(guò)旋轉(zhuǎn)，顯微鏡用戶(hù)可以沿著光軸移動(dòng)透鏡組的一部分，以補(bǔ)償覆蓋層厚度偏差并消除球面像差。顯微鏡用戶(hù)可以輕松地旋轉(zhuǎn)校正環(huán)，來(lái)回移動(dòng)對(duì)焦，直到達(dá)到*佳圖像為止。但是，糾正環(huán)也有限制。當(dāng)蓋玻片厚度*過(guò)標(biāo)準(zhǔn)太多或者蓋玻片材料是不同的材料時(shí)，不能使用它們。一般來(lái)說(shuō)，使用具有高數(shù)值孔徑的物鏡時(shí)，選擇厚度偏差小的1號(hào)S覆蓋玻片是個(gè)好主意。

*近，新的和不同的顯微鏡技術(shù)伴隨著更高的性能要求。覆蓋層和修正環(huán)起著關(guān)鍵作用，使這種增強(qiáng)的性能成為可能。