徠卡顯微鏡通過(guò)測(cè)量熒光基團(tuán)位移分析的離子濃度

一個(gè)小區(qū)的許多基本功能極大地依賴于離子的微妙的，但盡管如此動(dòng)態(tài)結(jié)余（如鈣，鎂），電壓電位和細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中的pH值和周圍的細(xì)胞外空間。改變這些余額顯著改變細(xì)胞的行為和功能。因此，在實(shí)時(shí)的細(xì)胞內(nèi)離子，電壓和pH動(dòng)力學(xué)的測(cè)量對(duì)于研究人員在神經(jīng)科學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞生理學(xué)中一般巨大的興趣。在很多情況下，然而，實(shí)際的離子濃度或在細(xì)胞或蜂窩網(wǎng)絡(luò)的不同位置的相對(duì)變化的精確估計(jì)很難與傳統(tǒng)的熒光的方法。其原因是，這些方法沒(méi)有考慮以下事實(shí)：在一個(gè)小區(qū)的不同部分或在蜂窩網(wǎng)絡(luò)中的細(xì)胞類型之間的細(xì)胞形態(tài)的差異可能影響其質(zhì)量和發(fā)射的光的量的帳戶。這可能導(dǎo)致重大的錯(cuò)誤解釋當(dāng)離子濃度，電壓或pH值的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究。比例的成像技術(shù)，通過(guò)觀察熒光團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)變化或通過(guò)比較熒光團(tuán)組合的發(fā)光強(qiáng)度，而不是測(cè)量光強(qiáng)度的變化繞過(guò)這些問(wèn)題。

離子濃度和pH值或電壓的變化，通過(guò)測(cè)量熒光團(tuán)的發(fā)射偏移的估計(jì)

徠卡顯微鏡研究活動(dòng)越來(lái)越多地把重點(diǎn)放在確定和時(shí)空分布如當(dāng)?shù)氐摹盁狳c(diǎn)”中的離子濃度，電壓或pH值的單元格或蜂窩網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)變化。這樣的“熱點(diǎn)”通常定位于細(xì)胞的專門部件或在某些小區(qū)的蜂窩網(wǎng)絡(luò)中。此外，相比于試樣中的細(xì)胞代謝或結(jié)構(gòu)方面的其余部分，這些區(qū)域通常具有不同的性質(zhì)。用于研究的動(dòng)態(tài)生理狀態(tài)的常規(guī)熒光團(tuán)經(jīng)離子結(jié)合，pH值的變化或電壓變化而改變其發(fā)光強(qiáng)度（對(duì)鈣結(jié)合如熒光4增加排放）。然而，這些標(biāo)記不考慮在結(jié)構(gòu)，直徑或標(biāo)記物的攝取/表達(dá)的差異可以引起變化的發(fā)射光的那是不符合實(shí)際的離子濃度，電壓或pH值的相關(guān)性的量。定量和同等檢測(cè)的變化，蜂窩結(jié)構(gòu)或不同的細(xì)胞，不敏感的方法來(lái)構(gòu)造直徑和熒光團(tuán)的濃度是必要的。而相比之下，非比例的成像方法，比率成像提供了機(jī)會(huì)，可重復(fù)地測(cè)量絕對(duì)細(xì)胞內(nèi)離子，電壓和pH值/變化相對(duì)于細(xì)胞直徑，熒光團(tuán)濃度和成像設(shè)置的光學(xué)性質(zhì)。但是，比例成像依賴于激發(fā)波長(zhǎng)或檢測(cè)波長(zhǎng)，具有強(qiáng)大的光源，光學(xué)元件和快速信號(hào)檢測(cè)的優(yōu)異的變速器的快速變化。超快濾光輪，UV光固優(yōu)化的目標(biāo)，高度敏感的熒光基團(tuán)和新的CCD相機(jī)的最新發(fā)展使得在高空間分辨率實(shí)惠的定量高速活細(xì)胞成像。

雙波長(zhǎng)激發(fā)/檢測(cè)是關(guān)鍵，用于測(cè)量熒光團(tuán)的發(fā)射移

如上面所提到的，在比率量度成像的發(fā)射偏移僅僅強(qiáng)度變化，而 不是被成像。為了測(cè)量發(fā)射的變化，熒光團(tuán)或熒光基團(tuán)結(jié)合的強(qiáng)度的變化，必須使用兩個(gè)不同的激發(fā)波長(zhǎng)或者通過(guò)檢測(cè)在兩個(gè)不同的發(fā)射波長(zhǎng)的任一測(cè)得的。在常用的鈣成像染料的fura-2的情況下，該染料具有被激發(fā)光在340 nm和380nm處檢測(cè)波長(zhǎng)的波長(zhǎng)是510納米。在對(duì)比的是，鈣成像染料吲哚-1-通常是激發(fā)光在350nm的波長(zhǎng)和檢測(cè)波長(zhǎng)為405納米和485納米。

圖1：使用比例鈣指示劑Fura-2從鈣成像實(shí)驗(yàn)的時(shí)間推移的快照。描繪的是經(jīng)過(guò)340納米（左）和380納米（中間）的激發(fā)和相應(yīng)的計(jì)算出的比率的圖像（右）的假色的圖像。所述圖像系列示出了三個(gè)點(diǎn)在時(shí)間：在時(shí)間的第一點(diǎn)（1）單元，不刺激，細(xì)胞內(nèi)鈣離子是在靜息水平。在第二時(shí)間點(diǎn)（2）的細(xì)胞受到刺激和鈣是在最大水平。在第三時(shí)間點(diǎn)（3）的細(xì)胞內(nèi)鈣水平下降。在該曲線圖在時(shí)間上的對(duì)應(yīng)點(diǎn)被標(biāo)記。上部的曲線示出了340nm處的圖像的強(qiáng)度，中間的圖中的380nm處的圖像和下部曲線圖中，顯示了比強(qiáng)度。

但是，為什么是必要的雙重激發(fā)或發(fā)射檢測(cè)？為什么就不能衡量變化的熒光強(qiáng)度？

定，其中熒光團(tuán)被用于檢測(cè)改變離子的水平，電壓或pH值的實(shí)驗(yàn)，發(fā)射的熒光的光的強(qiáng)度取決于幾個(gè)特性。這些將在下面的方程式所描述：

F =熒光強(qiáng)度; C =熒光濃度; D =直徑試樣（Z軸）; K =光在光路元件的常數(shù)（電池特性，目標(biāo)，過(guò)濾器等）; F（X）介紹，如果如離子結(jié)合或發(fā)生電壓/ pH值的變化給定的熒光團(tuán)的發(fā)射行為。

該方程表明，該光強(qiáng)度非常依賴于熒光團(tuán)的光路中的量。熒光團(tuán)的光路中的量取決于熒光團(tuán)在細(xì)胞和樣品（四）的直徑（通過(guò)標(biāo)記的攝取或表達(dá)確定的）（多個(gè)）的實(shí)際濃度（c）在被成像。這使得它很難直接通過(guò)簡(jiǎn)單地觀察熒光強(qiáng)度，例如，人們不能狀態(tài)估計(jì)的研究離子，pH值或電壓變化的濃度：“100強(qiáng)度等于游離鈣在細(xì)胞中的100nM的”。試樣直徑（d），熒光團(tuán)的濃度（c）和檢體和設(shè)置（K）的光學(xué)特性幾乎沒(méi)有可測(cè)量的，但基本上影響整體的強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。此外，它必須牢記的是，以上所示的公式為真，在檢體任何給定的點(diǎn)。隨著直徑（d）和熒光團(tuán)濃度（c）是不均質(zhì)的整個(gè)一個(gè)試樣，甚至在單個(gè)細(xì)胞，對(duì)c和d的值可能是在被檢查物的所獲取的圖像的每一個(gè)像素的不同。如果，例如在點(diǎn)“A”，在樣品中的細(xì)胞的直徑是相當(dāng)高的和游離鈣相當(dāng)?shù)?，光?qiáng)度可能是相同的點(diǎn)“B”，它是相對(duì)的。實(shí)驗(yàn)者然而，可能錯(cuò)誤地推斷出鈣離子濃度是在這兩個(gè)地方相似，作為檢測(cè)到的熒光的光強(qiáng)度是類似的。

圖。2：草圖以上是想說(shuō)明，如果在小區(qū)內(nèi)如鈣濃度是通過(guò)一種非比例鈣敏感的熒光團(tuán)的發(fā)射光的強(qiáng)度來(lái)判斷可能發(fā)生的錯(cuò)誤解釋。草圖下面的曲線代表光強(qiáng)度的感興趣區(qū)域（ROI）中的細(xì)胞的不同部分的區(qū)域。
在上面的圖像（A）中的細(xì)胞在不同的區(qū)室像細(xì)胞的突起這往往是不同的厚度（四中的表現(xiàn)公式）精細(xì)結(jié)構(gòu)（例如樹突和神經(jīng)元軸突）。作為上述光路內(nèi)的所有熒光團(tuán)被激發(fā)光激發(fā)而其發(fā)射的光被收集，小區(qū)的較厚部位出現(xiàn)比薄的部分明亮得多。這可能導(dǎo)致的假設(shè)，即在細(xì)胞中的較厚部分中的鈣濃度比可比較薄部分更高，盡管實(shí)際的鈣濃度是相同的。
在下面的草圖（B）不同的情況被示出。在某些細(xì)胞類型的熒光團(tuán)占據(jù)的細(xì)胞區(qū)室之間可能有所不同。在下部草圖的情況下，鈣濃度（三式中的）中的單元格的更厚的部分較高，但在該領(lǐng)域中的熒光團(tuán)濃度較低。作為鈣敏感染料的檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度不僅依賴于鈣離子濃度的細(xì)胞，而且還對(duì)熒光團(tuán)濃度，人們可能會(huì)得到的印象是，在整個(gè)細(xì)胞中的鈣濃度是相同的。

為了克服這些問(wèn)題，并為絕對(duì)的離子濃度，pH值或電壓的精確測(cè)量，比例成像已經(jīng)研制成功。所有比率的方法的共同之處在于，發(fā)射的光的強(qiáng)度被測(cè)量?jī)纱危@些強(qiáng)度的比（R）的計(jì)算方法。根據(jù)不同的熒光團(tuán)或所用的熒光團(tuán)的組合，所述熒光團(tuán)或者是激發(fā)光的兩個(gè)不同波長(zhǎng)和發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)量是在一個(gè)波長(zhǎng) - 或熒光團(tuán)或熒光團(tuán)的組合是激發(fā)光1的波長(zhǎng)和發(fā)射的測(cè)量是在兩個(gè)不同波長(zhǎng)的光。這只是意味著兩個(gè)灰度值的圖像被獲取和一比圖像從它們算出。兩個(gè)灰度值的圖像通常有不同的強(qiáng)度，但在圖像中每一個(gè)象素的強(qiáng)度可以通過(guò)如下所示的公式來(lái)描述：

F =熒光強(qiáng)度; C =熒光濃度; D =直徑試樣（Z軸）; K =光在光路元件的常數(shù)（電池特性，目標(biāo)，過(guò)濾器等）; F（X）介紹，如果如離子結(jié)合或發(fā)生電壓/ pH值的變化給定的熒光團(tuán)的發(fā)射行為。

正如其名稱比率成像意味著，對(duì)于兩個(gè)同時(shí)獲得的圖像的每一個(gè)像素的比例值來(lái)計(jì)算。例如，如果非常常用的鈣敏感染料的Fura-2（激發(fā)在340nm和380nm處）的情況下，所得到的公式將是：

根據(jù)簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)，C，D和K可以被取消，其比例是可以描述為：

虛擬圖像比例是由兩個(gè)灰度值圖像計(jì)算

在實(shí)踐中，該比例是通過(guò)一個(gè)計(jì)算機(jī)在一個(gè)時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)計(jì)算出的，在許多情況下，聯(lián)機(jī)。通過(guò)計(jì)算相應(yīng)的兩個(gè)獨(dú)立采集的灰度值的圖像的像素的灰度值的比率，該比率圖像被創(chuàng)建。請(qǐng)記住，灰度值的圖像基本上都是灰度值與相機(jī)分辨率的大小或感興趣區(qū)域（ROI）的區(qū)域的矩陣（通常是512×512，最多不超過(guò)1000×1000像素）。在鈣成像時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)與染料的Fura-2（激發(fā)：340納米和380納米，發(fā)射：510納米）這會(huì)工作如下（假設(shè)該圖像具有尺寸3×3個(gè)像素）：

圖3：強(qiáng)度讀數(shù)值的簡(jiǎn)化圖示的CCD照相機(jī)可以使用鈣探針呋喃-2傳送到計(jì)算機(jī)中的鈣成像實(shí)驗(yàn)這一點(diǎn)。在這種情況下，圖像將是3×3像素的大小。上面三個(gè)矩陣代表在鈣擱置濃度強(qiáng)度讀數(shù)值在340 nm和380 nm激發(fā)加上相應(yīng)的比率值。照片下部三個(gè)矩陣表示在高亮像素時(shí)鈣升高的亮度值的變化。在340nm處激發(fā)的增加值，而在380nm處激發(fā)減小的值。然而，相應(yīng)的比例值也將增加。

執(zhí)行用于每個(gè)圖像對(duì)中一個(gè)時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)的每一個(gè)像素這一操作，生成的比值圖像棧。最后，以假色圖可以應(yīng)用到比圖像棧和堆然后可以觀看并定量象正?；叶戎档臅r(shí)間推移的電影。

除了上面提到的優(yōu)點(diǎn)，一個(gè)比的計(jì)算有一個(gè)附加的優(yōu)點(diǎn)。在進(jìn)行活細(xì)胞成像離子，電壓或pH敏感的熒光，熒光強(qiáng)度在相應(yīng)波長(zhǎng)的微小變化經(jīng)常發(fā)生。在比成像，但是，強(qiáng)度的增加在一個(gè)波長(zhǎng)和強(qiáng)度降低，在其它波長(zhǎng)是在大多數(shù)情況下，觀察到的（不管探針是否被激發(fā)或用兩個(gè)波長(zhǎng)檢測(cè)）。如果這兩個(gè)獲得的圖像的比例，隨后計(jì)算，基線和信號(hào)振幅之間的差會(huì)相對(duì)于熒光團(tuán)的光強(qiáng)度變化被增強(qiáng)。因此，比成像放大檢測(cè)到的信號(hào)的振幅。這是為熒光共振能量轉(zhuǎn)移測(cè)定法特別感興趣，這里的受體蛋白質(zhì)的下降的熒光強(qiáng)度和能量傳輸過(guò)程中的受體蛋白質(zhì)的增加的熒光強(qiáng)度。