徠卡顯微鏡在透明的動物更深刻的見解

透明的生物幫助我們確定空間布局和細(xì)胞和組織，尤其是神經(jīng)回路可以很容易地被識別和表征的連接。徠卡顯微鏡凈度是大家議論的焦點(diǎn)。VIVIANA Gradinaru，助理教授，加州技術(shù)研究所，進(jìn)一步發(fā)展的方法和最近被渲染整個(gè)嚙齒動物體透明度引起了轟動。在這次采訪中，她對清算戰(zhàn)略及其對現(xiàn)代科學(xué)的影響的進(jìn)展評論。

圖1：腦細(xì)胞：熒光標(biāo)記的腦細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)完整的腦組織3-D可視化。通過使用這種新的全身結(jié)算及染色方法，研究人員可以使生物體的組織透明 - 讓他們期待通過生物體特定的細(xì)胞已被標(biāo)記或染色的組織（來源:Bin Yang and Viviana Gradinaru） 。

你已經(jīng)參與了最初的CLARITY出版卡爾戴瑟羅特。什么是您在清晰的發(fā)展中的作用？

我開始導(dǎo)致凈度與卡爾戴瑟羅特談話后2010年初該項(xiàng)目。這是在實(shí)驗(yàn)室中唯一的非光遺傳學(xué)的項(xiàng)目，因此需要不同的基礎(chǔ)設(shè)施。與此同時(shí)初步的實(shí)驗(yàn)，我建立一個(gè)新的建筑，也就是現(xiàn)在的數(shù)控程序（包括生化，外科，顯微能力）的家中一個(gè)特殊的CLARITY實(shí)驗(yàn)室。

在開始的時(shí)候，只有Charu萊瑪克里斯南，研究助理和實(shí)驗(yàn)室經(jīng)理，我的工作項(xiàng)目。但它需要高度跨學(xué)科的技能。所以，卡爾期待通過他的博士后申請者找人化學(xué)工程專業(yè)知識（尤其是水凝膠，這是我們認(rèn)為可以用來支持清組織），并發(fā)現(xiàn)申請人他的實(shí)驗(yàn)室誰想要工作在干細(xì)胞和光遺傳學(xué)項(xiàng)目，但誰也有化學(xué)工程專業(yè)。這是Kwanghun涌佐治亞理工學(xué)院，誰加入了我們作為一個(gè)博士后，大約一年后到項(xiàng)目中。和Logan Grosenick，例如加入了我們的專業(yè)成像，硬件和軟件明智的。Kwanghun然后執(zhí)行它作為第一代凈度的驅(qū)動力。

通過引入水凝膠拿出擺在首位清算組織的想法是怎樣？

最初我們想使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耐用UND刪除元素分心觀察。因此，我們旨在指導(dǎo)神經(jīng)元建立一個(gè)內(nèi)骨骼，例如通過表達(dá)角蛋白或甲殼素，應(yīng)該穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)的大腦已經(jīng)被取出后。需要支持的水凝膠。水凝膠包埋的兩個(gè)想法并為特定的神經(jīng)元回路的更簡單的可視化去除元件已經(jīng)在主**和描述了利用卡爾戴瑟羅特箱。在那個(gè)時(shí)候，我們認(rèn)為器官結(jié)構(gòu)使用低滲休克，內(nèi)切酶消化，熱等的消化遠(yuǎn)離目標(biāo)內(nèi)骨骼結(jié)構(gòu)。我們認(rèn)為，更多的立體支持，應(yīng)通過任何合適的基質(zhì)，如膠原蛋白，樹脂或水凝膠的支持。在我們的工作中，我們注意到，該水凝膠本身，這結(jié)束了丙烯酰胺，是足以穩(wěn)定組織結(jié)構(gòu)和更好（更深）的可見性可以通過除去脂類而得到。

你有沒有注意到影響CLARITY會對科學(xué)在那個(gè)時(shí)候？

是。想想對線蟲，或斑馬魚的所有研究，認(rèn)為可以很容易地識別基因突變及其對器官發(fā)育和存活的后果：之前我們已經(jīng)學(xué)到了很多，從自然透明的生物。有些這樣的工作被認(rèn)可了諾貝爾文學(xué)獎于2002年。不幸的是，翻翻哺乳動物組織是不是同樣一件容易的事，由于光散射血脂是目前全厚組織，包括細(xì)胞膜，使機(jī)關(guān)不透明。

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• 圖2：腎細(xì)胞：熒光標(biāo)記的腎細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)完整的腎組織3-D可視化。通過使用這種新的全身結(jié)算及染色方法，研究人員可以使生物體的組織透明 - 讓他們看看通過一個(gè)有機(jī)體已經(jīng)標(biāo)記或染色的特定細(xì)胞的組織（（Yang等，2014）。信用：細(xì)胞，Bin Yang and Viviana Gradinaru）。
  

能否請您介紹的進(jìn)步協(xié)定，凈度呢？什么是克服挑戰(zhàn)？

PACT 僅被動凈度，以調(diào)整，使該水凝膠的孔大，以加快被動脂質(zhì)去除和增加抗體的穿透。我們試圖清除組織，而無需使用一個(gè)電場，它原來的方法使用的，但在挑戰(zhàn)來實(shí)現(xiàn)，并可能損壞組織。

你是如何開發(fā)RIMS？

我們最初的論文中使用FocusClear。然而，許多實(shí)驗(yàn)室努力實(shí)現(xiàn)方法是擔(dān)心缺乏可用性和成本。我們開發(fā)的輪輞（折射率匹配液），使我們和其他人的工作更容易和經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的。RIMS是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的替代FocusClear，研究人員可以在實(shí)驗(yàn)室中，也可以不破壞熒光用來存儲樣本數(shù)月。這是說，我們的樣品也給了很好的效果，當(dāng)在一個(gè)簡單的山梨醇溶液（我們稱之為成像sRIMS我們給在紙上的配方為好）。

如何全身結(jié)算所PARS工作？

在小區(qū)目前的報(bào)告是建立在CLARITY方法來實(shí)現(xiàn)整個(gè)成年機(jī)體清除和染色。這是可能的，因?yàn)楸菊餮h(huán)系統(tǒng)（例如脈管系統(tǒng)）可以用于實(shí)現(xiàn)結(jié)算而不是洗滌劑和標(biāo)簽的被動擴(kuò)散，這將是大的器官或整個(gè)生物體過于緩慢的實(shí)現(xiàn)。這是PARS方法，簡稱P erfusion輔助一個(gè)紳士? elease在S ITU。

嚙齒動物的血管路由用于介紹和分發(fā)所需的解決方案：固色劑，洗滌緩沖液，水凝膠的解決方案和SDS清潔劑和緩沖劑。甚至抗體染色，通過心臟灌注完成。對大腦和脊髓的結(jié)算，我們建議顱內(nèi)灌注進(jìn)入腦脊液路線（PARS-CSF）。整個(gè)過程可以在2個(gè)星期的時(shí)間最大可以實(shí)現(xiàn)。大部分器官在幾天內(nèi)清楚。并且這種方法也可應(yīng)用到其它生物 - 例如人尸體 - 雖然成像和數(shù)據(jù)分析可成為隨卷調(diào)查的瓶頸。

什么是克服主要挑戰(zhàn)是什么？

還有我們不得不照顧三個(gè)主要問題：保護(hù)組織的完整性，其中包括防止器官變形和精細(xì)的軸突或表位的損害，達(dá)到最低蛋白質(zhì)和核酸的損失和保留，在適用時(shí)，內(nèi)源性熒光 - 所有這些，同時(shí)還清理組織比被動的結(jié)算將允許更快。雖然透明度，映入眼簾的是結(jié)算的一個(gè)粗略指標(biāo) - 完全透明組織是不是主要目標(biāo)，因?yàn)閛verclearing也可以發(fā)生在組織的完整性成本。我們清除了足夠的樣本來檢測的分子標(biāo)記物，包括RNA轉(zhuǎn)錄的單分子分辨率。

這些是什么新穎的光學(xué)結(jié)算方法給出科學(xué)的可能性？其中新的應(yīng)用領(lǐng)域，你的未來看到了什么？

一個(gè)透明的全生物體是特別有用的映射在其靶器官的整個(gè)身體內(nèi)的分布和外周神經(jīng)的分子身份; 這樣的神經(jīng)然后可以與光遺傳學(xué)在疾病的動物模型調(diào)制理解什么需要調(diào)諧，以改善癥狀和所得到的知識，可以促進(jìn)依賴于，例如更好的療法，電刺激神經(jīng)更好器官功能或用于減少慢性疼痛。雖然這是很難預(yù)測的研究將如何迅速進(jìn)步，達(dá)到臨床試驗(yàn)階段，有大量的動力和積極性。制藥公司越來越熱衷于創(chuàng)造光遺傳學(xué)的單位，我們也有在PARS結(jié)算，這甚至可以在人體組織中使用的興趣。我們誰是從誰死阿爾茨海默病或癡呆的患者使用的凈度（PACT）在人腦組織中被動形式合作者。我們還表明，它的工作原理，從一個(gè)人的皮膚癌患者檢測癌細(xì)胞的活組織檢查。希望通過組織與細(xì)胞和蛋白質(zhì)的分辨率可以讓我們對病理進(jìn)展很大 - 這是邁向更好的治療方法的第一步。

你的主要研究重點(diǎn)是光遺傳學(xué)。如何做光學(xué)結(jié)算和光遺傳學(xué)結(jié)合起來？

PARS補(bǔ)充光遺傳學(xué)的，因?yàn)樗梢越沂竟膺z傳學(xué)操作的電路全效果，也有助于在需要調(diào)諧在疾病映射新穎電路。

在光遺傳學(xué)，我們修改了嚙齒動物大腦的神經(jīng)元，使他們響應(yīng)和光誘導(dǎo)的模式生物在一定的行為。當(dāng)你閃耀一盞燈，在神經(jīng)元激發(fā)。當(dāng)你把它關(guān)掉，神經(jīng)元停止射擊。我們希望從光遺傳學(xué)，詳細(xì)了解大腦是如何的功能。研究大腦的動物模型功能，如鼠類，增加了我們?nèi)祟惖拇竽X是如何工作的理解 - 而且，有了它，我們設(shè)計(jì)出更好的治療腦相關(guān)疾病的能力。

一個(gè)主要的挑戰(zhàn)是確定其顯示處理后的治療效果的電路。我們沒有穿過大腦連接的詳細(xì)地圖。這可能是一個(gè)問題，因?yàn)槲覀兊哪X深部刺激現(xiàn)有光遺傳學(xué)研究表明。這電腦深部電刺激可能會從根本上采取行動，通過腦白質(zhì)遠(yuǎn)離電極部位突出了需要更好的大腦地圖。然而，難以創(chuàng)造這樣的地圖為束狀整個(gè)大腦運(yùn)行良好時(shí)，軸突做到這一點(diǎn)的常用方法是切片的組織中紙一樣薄的薄片，再成像各一臺，并與圖像處理軟件把它全部背起來：它是緩慢的，乏味的，昂貴的且易于出錯(cuò)。清除組織使我們能夠可視化和鑒定細(xì)胞成分和它們的無切片分子的身份。

該視頻顯示在不同深度的逐步的橫截面圖像在整個(gè)熒光標(biāo)記的完整腸組織。在這些圖像中，血管被標(biāo)記為綠色，細(xì)胞被標(biāo)記為紅色，并且細(xì)胞核被標(biāo)記為藍(lán)色。使用PARS技術(shù)圖像拍攝（來源：楊斌和VIVIANA Gradinaru）。