徠卡顯微鏡EM樣品制備
徠卡顯微鏡EM樣品制備
由于在電子顯微鏡的對(duì)比度主要取決于在小區(qū)中的有機(jī)分子的電子密度的差異，污漬的效率是由附著在生物結(jié)構(gòu)污漬的原子量來(lái)確定。 因此，使用最廣泛的污漬在電子顯微鏡是重金屬鈾和鉛。 盡管單獨(dú)使用這些污漬中的一個(gè)可能是相當(dāng)實(shí)用的常規(guī)用途中，當(dāng)這兩個(gè)污漬中使用的序列，“雙反襯”，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，獲得最高的對(duì)比度。
介紹
因此，在網(wǎng)格上以乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛超薄切片的二重造影法的標(biāo)準(zhǔn)例程反襯技術(shù)用于電子顯微鏡。 雖然這種技術(shù)是眾所周知的對(duì)比是樣品制備用于電子顯微鏡中最關(guān)鍵的步驟之一。 除了人工處理，所用的化學(xué)品特別的屬性，這可能會(huì)導(dǎo)致沉淀的人工制品，都是錯(cuò)誤的因素。
醋酸雙氧鈾（UA），這增強(qiáng)通過(guò)相互作用的對(duì)比度與脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，形成一個(gè)黃色的針狀晶體析出，如果在右濃度，如果多余的UA不從部分除去未使用。 的檸檬酸鉛，它通過(guò)與蛋白質(zhì)和糖原相互作用增強(qiáng)了對(duì)比度，會(huì)形成水不溶性有毒的白色沉淀（碳酸鉛），如果不是無(wú)二氧化碳排放的條件下嚴(yán)格使用。 避免的 CO 2中的手動(dòng)過(guò)程是困難的其中一個(gè)特殊的過(guò)程是必要的。
再現(xiàn)性的科學(xué)需求，具有低試劑消耗在一側(cè)和安全的工作條件通過(guò)避免與在另一側(cè)的危險(xiǎn)試劑接觸的要求高品質(zhì)的樣品可被滿足，以標(biāo)準(zhǔn)化的，封閉的和自動(dòng)化的過(guò)程。
根據(jù)這些要求，徠卡顯微鏡開(kāi)發(fā)的全自動(dòng)徠卡EM AC20。 自動(dòng)對(duì)比與現(xiàn)成的預(yù)包裝UA和檸檬酸鉛染色確保與試劑的最低用戶聯(lián)系，并消除了人工染色幾乎所有的傳統(tǒng)問(wèn)題，如鈾和鉛的沉淀，健康風(fēng)險(xiǎn)和高試劑消耗。
漬
在電子顯微鏡中最廣泛使用的污漬是重金屬，鈾和鉛。 超薄切片用醋酸雙氧鈾（UA）和檸檬酸鉛雙重造影法的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比技術(shù)用于電子顯微鏡（圖1和2）。
在本章中，我們將討論UA的特點(diǎn)和檸檬酸鉛及其優(yōu)點(diǎn)和根據(jù)對(duì)比過(guò)程中的缺點(diǎn)。
圖1：在水絲蚓屬的環(huán)帶區(qū)腺細(xì)胞顆粒。 圖2：水絲蚓屬的縱向肌肉。
醋酸鈾
UA（圖3）的優(yōu)點(diǎn)在于，它產(chǎn)生最高的電子密度和圖像對(duì)比度，以及賦予細(xì)晶粒的圖像由于鈾238的原子量。 鈾酰離子結(jié)合的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)與唾液酸的羧基基團(tuán)，例如糖蛋白和神經(jīng)節(jié)苷脂和核酸的DNA和RNA的酸式磷酸酯基團(tuán)。
圖3：市售的黃
神經(jīng)節(jié)苷脂是糖脂和集中在細(xì)胞的表面上。 糖蛋白中富含所有膜和多糖包的一部分。 因此UA傳遞膜，核酸以及含有蛋白復(fù)合物的核酸，如核糖體的良好的反襯效果。
從左至右依次為：醋酸根離子，鈾酰離子，醋酸鈾結(jié)構(gòu)式
UA的缺點(diǎn)是它的光，特別是紫外線的靈敏度，并且將沉淀物如果暴露。 老化時(shí)，也沉淀。 此外，UA是既放射性和毒性。 從貧化鈾制成的正常商業(yè)股有0.37-0.51微居里/克典型的放射性。 這是放射性的一個(gè)非常溫和的水平，是不充分的有害同時(shí)該材料仍然是外部給體。 如果食入，吸入粉塵或皮膚接觸，如果皮膚被切斷或磨損是非常有毒的。 該毒性是由于化學(xué)毒性和輕度放射性的組合效應(yīng)而存在的，從長(zhǎng)期接觸累積效應(yīng)的危險(xiǎn)。
醋酸鈾解決方案
UA正在使用，也可以作為醇（乙醇或甲醇）或水溶液。 這兩種類型的雙氧鈾溶液有個(gè)別的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。
酒精醋酸鈾
醇污點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn)是，它會(huì)更容易地滲透到塑料包埋的組織，從而得到高對(duì)比度，只需要很短的染色時(shí)間。
醇溶液的制備通常是在50％-70％乙醇或無(wú)水甲醇中的飽和溶液。
在甲醇中，得到最高的溶解度。 因此，可能的最高對(duì)比度由飽和甲醇乙酸雙氧鈾染色給出。
酒精，特別是甲醇的醋酸雙氧鈾是化學(xué)侵蝕性的溶液。 因此，多孔材料的增強(qiáng)抽出應(yīng)使用甲醇醋酸鈾時(shí)予以考慮。 酒精UA溶解colloidin-parlodion支持膜，如果染色時(shí)間可以延長(zhǎng)，甚至溶解膜聚乙烯醇縮甲醛。 它也有許多塑料和橡膠產(chǎn)生負(fù)面影響。
水醋酸鈾
為了獲得UA的污點(diǎn)的具體作用，它應(yīng)當(dāng)作為一個(gè)水溶液。
當(dāng)UA正在溶解在水中，將溶液的pH值的范圍為4.2至4.9視濃度（0.5％?3％）。 在此pH下該雙氧鈾物質(zhì)與正電荷支配和染色液給出一個(gè)足夠的對(duì)比。 帶負(fù)電荷的分子，如核酸，污點(diǎn)特別好。
水性污漬是不穩(wěn)定的，也很光敏在此pH范圍內(nèi)。 老化的溶液和光照射的引線和四價(jià)鈾的氫氧化物既鈾氫氧化物沉淀。
四價(jià)鈾也沉淀在某些有機(jī)離子，如包埋介質(zhì)的未聚合的單體存在下，如下所示：
因?yàn)槲蹪n具有較低的pH值，不推薦用于與樣品是不穩(wěn)定的在酸性條件下使用。 另外，色斑沉淀在生理pH下，在許多的鹽和非常謹(jǐn)慎的存在下使用時(shí)是需要的。 因此，過(guò)濾的污點(diǎn)應(yīng)在4℃下儲(chǔ)存在暗處且可用于數(shù)個(gè)月。
穩(wěn)定的解決方案
UA的穩(wěn)定是必需的，以避免沉淀更長(zhǎng)的存儲(chǔ)時(shí)間。 沉淀可以在UA被酸化穩(wěn)定完全避免。 酸化然而，大大降低了染色效果。 在pH 3.5鈾離子的附著于DNA是強(qiáng)，也比在pH4.0更具體的，因?yàn)樵谠損H僅DNA具有負(fù)電荷。 在pH低于3.5雙氧鈾染色將反應(yīng)非常弱的組織成分，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的蛋白質(zhì)甚至核酸不再是在較低pH值下帶負(fù)電荷。
徠卡Ultrostain我（醋酸鈾溶液）
徠卡Ultrostain我對(duì)應(yīng)于一個(gè)穩(wěn)定的0.5％，pH為4.4乙酸雙氧鈾溶液。 它是預(yù)先裝在棕色200毫升瓶以保護(hù)其免受光。 這是在一個(gè)特殊的風(fēng)險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)品生產(chǎn)廠，這是幾乎不可能安排在一個(gè)EM-實(shí)驗(yàn)室條件下。
沉淀
在常規(guī)的對(duì)比過(guò)程，這些問(wèn)題具有UA都比較容易被染色的反復(fù)更新，通過(guò)日常的過(guò)濾或離心分離來(lái)掌握。 在UA結(jié)晶在大正方形或菱形形成的晶體（或作為粒狀骨料，圖4）的針。
圖4：醋酸鈾沉淀
4％的制劑的含水醋酸雙氧鈾（重量/體積）原液
注意：醋酸鈾是非常有毒的，由于化學(xué)毒性和輕度放射性的組合效應(yīng)而存在的，從長(zhǎng)期接觸累積效應(yīng)的危險(xiǎn)。運(yùn)動(dòng)保健稱量粉末，總是戴乳膠手套，實(shí)驗(yàn)服，防護(hù)面罩和其他適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)（接觸實(shí)驗(yàn)室安全員！）
物料
乳膠手套，實(shí)驗(yàn)服，防護(hù)面罩
200毫升粗漿瓶（嚴(yán)格干凈?。?/span>
百毫升容量瓶（嚴(yán)格干凈?。?/span>
50毫升移液管（嚴(yán)格干凈！）
在通風(fēng)櫥中的平衡
稱量皿
熱板
磁力攪拌器和攪拌棒
的Whatman＃1濾紙
玻璃漏斗
醋酸鈾二水粉（貧）[U（C 2 H 3 O 3）2×2H 2 O]，4克
無(wú)二氧化碳排放雙蒸水，125毫升
注意：一旦玻璃器皿被污染的重金屬污漬它不應(yīng)該被用于制備其它化學(xué)溶液。
程序
權(quán)衡將4克醋酸雙氧鈾（UA）在通風(fēng)櫥下（磨損保護(hù)?。⑵涮砑拥?00ml容量的燒瓶中。 吸管96毫升近沸點(diǎn)的CO 2 -free雙蒸水與UA的燒瓶中。
放在攪拌器，直到醋酸鈾水合物晶體溶解。 這將需要一段時(shí)間。 后溶解讓溶液冷卻至室溫。
通過(guò)的Whatman＃1過(guò)濾到200 ml棕色瓶（避光），并蓋緊瓶蓋和標(biāo)簽過(guò)濾器的UA。 此原液可存放數(shù)月，在4℃。
沖洗受污染的玻璃器皿放入廢瓶UA解決方案，并從實(shí)驗(yàn)室玻璃器皿單獨(dú)存放。 被污染的UA固體廢物應(yīng)以固體廢物的容器留出放射性廢物處置（接觸實(shí)驗(yàn)室安全員?。?。
檸檬酸鉛
檸檬酸鉛增強(qiáng)了廣泛的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如核糖體，脂質(zhì)膜，cytoskleleton和細(xì)胞質(zhì)的其他車廂的對(duì)比效果。 的對(duì)比效果的提高依賴于具有降低的鋨的相互作用，因?yàn)樗试S鉛離子的附接至分子的極性基團(tuán)。 鋨常規(guī)地用作固定劑。 檸檬酸鉛也相互作用，在較弱的程度上，與UA，因此導(dǎo)致UA染色后檸檬酸染色使用。
檸檬酸鉛的缺點(diǎn)是它的實(shí)驗(yàn)室條件和耗時(shí)細(xì)膩制備下不可預(yù)測(cè)的行為（參見(jiàn)圖7）。 檸檬酸鉛容易析出在二氧化碳的存在下，或者在空氣中或在用于制備污漬或漂洗水。 碳酸鉛（PbCO 3）是一種不溶于水的有毒的白色沉淀物，因此不會(huì)在漂洗水中溶解。 一般來(lái)說(shuō)所有的鉛鹽如檸檬酸鉛是劇毒的。
領(lǐng)先的解決方案
鉛檸檬酸結(jié)構(gòu)式
鉛溶液的染色效果是高度相關(guān)的，如雙氧鈾溶液，在溶液的pH值。 不像鈾，但是，它有可能使用含鉛染色溶液在非常高的pH值（> 12 pH下）。
堿性Wenable＆Goggeshalls和雷諾的領(lǐng)先解決方案是最流行的。 通過(guò)這些方法，即雷諾（1963）更可靠的日常工作，僅僅是因?yàn)闄幟仕徙U的商業(yè)品質(zhì)并不總是符合要求的染色質(zhì)量。 在雷諾數(shù)方法，檸檬酸鉛形成為從檸檬酸鈉和硝酸鉛之間的反應(yīng)產(chǎn)物。
所有的堿性鉛污漬可以被認(rèn)為是穩(wěn)定的解決方案。 因此，這些解決方案是適合于商業(yè)處理，只要它們能消除碳酸鉛形成的條件下進(jìn)行。
徠卡Ultrostain II（檸檬酸鉛溶液）
徠卡Ultrostain II對(duì)應(yīng)于雷諾檸檬酸鉛。 3％的檸檬酸鉛溶液預(yù)氦氣氛下真空密封袋包裝。 這是根據(jù)極度小心完成在化學(xué)生產(chǎn)廠在一個(gè)特殊的風(fēng)險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)室，并在其中是不能夠?qū)崿F(xiàn)在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的EM-實(shí)驗(yàn)室條件。
沉淀
碳酸鉛（PbCO 3）是一種不溶于水的有毒的白色沉淀物。
它顯示為黑色顆粒的電子顯微鏡。 顆?？梢允谴蟮模▓D7a）和少數(shù)或部分可被覆蓋有細(xì)沉積物（圖7b）。
圖7A 圖7B
注意：鉛鹽是劇毒的。 在加權(quán)粉末小心。 佩戴合適的防護(hù)。
物料
50毫升量瓶中，用塑料或玻璃塞（嚴(yán)格干凈?。?/span>
25毫升移液管（嚴(yán)格干凈?。?/span>
pH計(jì)（嚴(yán)格干凈?。?/span>
磁力攪拌器和攪拌棒
鉛硝酸鉛[Pb（NO 3）2]，1.33克
檸檬酸鈉[娜3（C 6 H 5 O 7）×2H 2 O]，1.76克
無(wú)二氧化碳排放雙蒸水，加入100毫升（新鮮制備并冷卻到至少25℃）
1N的NaOH，將10毫升（以CO新鮮制備的2 -free雙蒸水）
程序
結(jié)合1.33克硝酸鉛，1.76克檸檬酸鈉和30ml無(wú)二氧化碳排放雙蒸水在50ml的容量瓶中。 搖動(dòng)溶液劇烈?guī)追昼姡缓?-6倍，在30分鐘的時(shí)間。 這將產(chǎn)生鉛染色的乳白色懸浮液，不含大的顆粒。 如果人們看到大段大段，繼續(xù)搖，直到顆粒被分離，或重新開(kāi)始。 攪拌在攪拌板上直到乙酸雙氧鈾水合物晶體（圖3）被溶解。 這將需要一段時(shí)間。 后溶解讓溶液冷卻至室溫。
加5?7毫升1N的NaOH，以懸浮液中，同時(shí)攪拌。 乳白色的解決方案應(yīng)該把清晰。 如果沒(méi)有，添加一些滴氫氧化鈉高達(dá)總8毫升。 如果解決方案仍無(wú)法啟動(dòng)清楚，什么是錯(cuò)的污漬應(yīng)該被丟棄！ 沖洗受污染的玻璃器皿放入廢瓶UA解決方案和存儲(chǔ)分離的實(shí)驗(yàn)室玻璃器皿。 被污染的UA固體廢物應(yīng)以固體廢物的容器留出放射性廢物處置（接觸實(shí)驗(yàn)室安全員！）。
撤回少量清晰染色并用pH計(jì)檢查pH值。 pH值應(yīng)為12.0 +/- 0.1。 如果pH值太低，添加更多的氫氧化鈉向澄清溶液中步驟2的燒瓶中，如果pH高于12.1開(kāi)始。
pH值已通過(guò)驗(yàn)證之后，無(wú)二氧化碳排放的水添加到量瓶中以使溶液于50 ml的終體積。 該瓶應(yīng)嚴(yán)格塞住。
該解決方案具有保質(zhì)期可達(dá)6個(gè)月，如果封得嚴(yán)嚴(yán)實(shí)實(shí)。 在使用前，離心（5000×克/ 10分鐘）或通道通過(guò)微。
注意：確切的pH值是這個(gè)污點(diǎn)極其重要的。 如果pH值超過(guò)0.1單位的pH從12.0變化，會(huì)發(fā)生染色差或沉淀。
對(duì)比過(guò)程
手冊(cè)反襯
在標(biāo)本電鏡的準(zhǔn)備，部分的手工染色，其中大部分故障都經(jīng)歷的步驟。 這里，柵格被置于乙酸雙氧鈾（UA）的溶液滴并除去后，在一定的溫育時(shí)間與鉗（圖8a和8b）。 然后柵格被置于檸檬酸鉛對(duì)孵化滴之前在水中沖洗幾次（圖9a和9b）。 為了防止檸檬酸鉛通過(guò)暴露于CO 2的沉淀，氫氧化鈉顆粒加入到染色皿中（此處的皮氏培養(yǎng)皿）中排除大氣中的CO 2。 另外，漂洗水應(yīng)CO 2 -free（雙蒸餾）。 染色后，該網(wǎng)格中的幾個(gè)熱水浴中并且通過(guò)使用水（圖9c）的射流再次漂洗。 芯吸和干燥后，網(wǎng)格可以被分析。
人工染色過(guò)程的主要問(wèn)題是在金屬的鹽的在染色過(guò)程中的沉淀，特別是鉛的沉淀。 NaOH顆粒的使用，以減少沉淀是一種常用的技術(shù)。 即使采用最佳的預(yù)防措施，析出可能破壞許多小時(shí)或工作甚至幾天，臨界半小時(shí)染色的過(guò)程中。
另一個(gè)被廣泛經(jīng)驗(yàn)的問(wèn)題就是網(wǎng)格，可以很容易地破壞影片的支持，甚至部分的反復(fù)操作。
因?yàn)榘ㄔS多步驟的手工操作，在整個(gè)染色時(shí)間的用戶的存在是必要的。 此外，當(dāng)只有少量的網(wǎng)格可同時(shí)染色時(shí)，程序必須經(jīng)常重復(fù)進(jìn)行。 因此，人工染色大大有助于在EM實(shí)驗(yàn)室的工作負(fù)荷。 如果多個(gè)序列或長(zhǎng)的連續(xù)切片的染色將被執(zhí)行，特別是如果短染色時(shí)間被使用的，一致的重現(xiàn)性是困難的，有時(shí)甚至是不可能獲得的。
最后通過(guò)的危險(xiǎn)化學(xué)品的反復(fù)操作時(shí)的污漬和染色的制備過(guò)程中的增加的健康風(fēng)險(xiǎn)是人工染色的一個(gè)主要缺點(diǎn)。
圖8A 圖 8B
圖9A 圖9B 圖9C
自動(dòng)化反襯
徠卡EM AC20自動(dòng)雙對(duì)比的超薄切片裝在格柵的傳統(tǒng)手工技藝。 該技術(shù)的設(shè)計(jì)提供了一個(gè)解決方案，大多數(shù)人工染色的傳統(tǒng)的問(wèn)題，如沉淀和不相等的染色結(jié)果。 此外，通過(guò)同時(shí)對(duì)比高達(dá)20格，自動(dòng)加速實(shí)驗(yàn)室程序和標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)比結(jié)果。 因此，用EM AC20全自動(dòng)染色給出了一個(gè)廣泛的重視改善的電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)室常規(guī)通過(guò)省去了傳統(tǒng)的染色問(wèn)題，減少了對(duì)健康的危害，并給予技術(shù)人員的時(shí)間為更有價(jià)值的工作。
該儀器采用預(yù)包裝的，穩(wěn)定的乙酸雙氧鈾（UA）的溶液和檸檬酸鉛染色，以盡量減少與危險(xiǎn)的化學(xué)品，并消除了降水和污染控制和標(biāo)準(zhǔn)化污點(diǎn)制備和裝瓶由于用戶的接觸（參見(jiàn)第2章）。 在Leica EM AC20的心臟是蠕動(dòng)泵和非接觸式的閥門系統(tǒng)，這意味著該試劑通過(guò)只是空氣密封腔管行進(jìn)。 該泵閥門，管件系統(tǒng)包含兩個(gè)獨(dú)立的管道設(shè)置窗口。 一個(gè)允許控制試劑的流和沖洗到爐柵室（圖9b）。 第二引導(dǎo)廢物從所述腔室到特定廢液瓶。
影響因素對(duì)比
在染色技術(shù)，用在對(duì)比質(zhì)量影響最大的因素是質(zhì)量和染色溶液的濃度。 旁邊的污漬，所述因素例如定香劑，緩沖劑，沖洗水，脫水，漂洗時(shí)間，包埋劑和聚合的程度以及切片厚度的類型影響的對(duì)比度也。
一般因素
固定劑
************固定劑增強(qiáng)了對(duì)比度。 它可以作為固定劑，以及后染色過(guò)程中的對(duì)比度增強(qiáng)器通過(guò)用乙酸雙氧鈾和鉛citrate.It已經(jīng)表明，固定時(shí)間對(duì)由乙酸雙氧鈾的對(duì)比得到的對(duì)比度的效果相互作用。 長(zhǎng)固定用************減少如染色質(zhì)的對(duì)比。
緩沖器
雙氧鈾與二甲胂酸鹽和磷酸鹽離子可以導(dǎo)致鈾酰鹽沉淀強(qiáng)烈反應(yīng)。 因此，無(wú)沉淀更高的對(duì)比度洗滌該樣品固定后廣泛時(shí)被獲得。
磷酸鹽緩沖液可以保持甚至脫水和包埋后的組織，往往會(huì)引起小的，本地的，致密物沉積在肌肉和神經(jīng)組織。
沖洗水
在CO 2含量的漂洗水的影響通過(guò)形成碳酸鉛沉淀的對(duì)比度。 新鮮蒸餾水的pH接近中性。 如果蒸餾水中靜置的很長(zhǎng)一段時(shí)間，CO 2從空氣中溶解。
此外，低pH <漂洗水中的6.0減小由醋酸雙氧鈾和因此也一般對(duì)比度給出的對(duì)比。 如果水的pH值低于6.0，加入KOH應(yīng)為中和加入。 沖洗水也應(yīng)脫氣或煮沸以防止氣泡其中，如果存在的話，附著在網(wǎng)格中的染色室和禁止染色的形成。
包埋劑
的Epon和EPON的替代物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在相似的方式進(jìn)行對(duì)比，因此，不需要特殊handling.Araldite已知，得到固有的背景染色。 因此，較短的對(duì)比時(shí)間在較低溫度下是recommended.Spurr包埋樹(shù)脂通常需要較長(zhǎng)的時(shí)間的對(duì)比。 最好是不染色斯珀?duì)枙r(shí)提高溫度，因?yàn)橄竦腁raldite，樹(shù)脂背景本身有一種傾向，占用嵌入試樣的stain.The年齡是很重要的，因?yàn)榘癫牧系木酆蟽?chǔ)存期間繼續(xù)進(jìn)行。 老標(biāo)本和部分需要更長(zhǎng)的醋酸鈾對(duì)比時(shí)間。
切片厚度
薄切片顯示對(duì)比度比厚的部分，但更高的分辨率下，由于存在對(duì)污漬較少的位點(diǎn)被綁定到。 因此，薄的部分需要較長(zhǎng)的染色時(shí)間比較厚的人。
聚合級(jí)
聚合的不好包埋劑是軟的，難以削減，占用污漬迅速。 因此，建議一個(gè)較短的對(duì)比時(shí)間在較低溫度下進(jìn)行。
整塊染色
試樣的嵌入前對(duì)比已經(jīng)成為近年流行的強(qiáng)化無(wú)沉淀物形成對(duì)比的方法。
然而，“整塊”染色本身并不提高試件的對(duì)比度足夠的大部分研究。 同時(shí)與部分郵政染色，醋酸鈾和檸檬酸鉛建議在大多數(shù)教科書(shū)。