徠卡顯微鏡熒光蛋白光譜特性的簡介

熒光顯微鏡的前景極大地改變熒光蛋白在20世紀(jì)50年代的發(fā)現(xiàn)。 其出發(fā)點(diǎn)是水母水母綠色熒光蛋白（GFP）通過檢測Osamo下村 。 數(shù)百GFP的突變體后，熒光蛋白的范圍達(dá)到從藍(lán)色到紅色的光譜。 更多的熒光蛋白來自其它物種的像珊瑚蟲未來的出現(xiàn)偏移發(fā)射波長連到遠(yuǎn)紅外區(qū)。 的可能性，這個(gè)調(diào)色板提供了科學(xué)家尋找他們的需求的絕佳選擇合適的熒光蛋白標(biāo)記。 本文提供的最新替代品的概述，并提供了明確安排表中所有相關(guān)的光譜特性。

從 A熒光蛋白 維多利亞

綠色熒光蛋白或其變體的光譜特性在于氨基酸結(jié)構(gòu)上形成的發(fā)色團(tuán) （圖1）。這可以是在3位的氨基酸65-67或殘基的接近這個(gè)位置（例如YFP）。 除了關(guān)于發(fā)色團(tuán)的主要突變，研究還對其他位點(diǎn)定向誘變進(jìn)行，以提高其它因素，如蛋白質(zhì)的成熟和表達(dá)在異種細(xì)胞系統(tǒng)（例如，密碼子使用，蛋白質(zhì)折疊在生理溫度下）。 需要注意的是A. 維多利亞是一個(gè)比較原始的海洋生物，無全身發(fā)熱系統(tǒng)。

即使GFP是因?yàn)樗牧炼群透吖夥€(wěn)定性的最流行的FP中的一個(gè)，它有兩個(gè)主要的缺點(diǎn)。 這些都是一定的敏感性至pH和輕微趨勢二聚化。 二聚化或寡聚化是許多FP的一個(gè)問題。 他們的偏好凝集彼此可產(chǎn)生偽像或關(guān)于融合蛋白的定位和功能的誤解。 但是，科學(xué)家們想出了一些答案的問題了。 其中，非極性氨基酸被親水性的物品所取代的突變，在臨界位置（F223R，L221K和A206K）顯示降低的二聚化。 所有這一切都導(dǎo)致頻譜的改善以及實(shí)際性狀的遺傳變化進(jìn)行了總結(jié)下“強(qiáng)化”的FP的名字。

在wtGFP的情況下，增強(qiáng)導(dǎo)致的EGFP（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）與在488nm處，而不是以前復(fù)雜的吸收光譜在395納米和475納米的單激發(fā)峰。 wtGFP的第一個(gè)變異版本（S65T突變）由Roger錢永健等人開發(fā)的。 比原來更亮5倍，并呈現(xiàn)出更短的熟化時(shí)間。 連同更好熟化效率，在37℃，根據(jù)另一個(gè)突變（F64L），這起著對人們在看活細(xì)胞中起重要作用。

一個(gè)非常有趣的GFP變體的最大的斯托克斯位移一個(gè)是藍(lán)寶石 。 的突變的位置附近的發(fā)色團(tuán)（T203I）導(dǎo)致的最大激發(fā)至399納米，最大發(fā)射至511毫微米的改變。 這是112毫微米的斯托克斯位移。 翡翠是另一個(gè)GFP的修飾具有改進(jìn)的光穩(wěn)定性和亮度和更有效的折疊在哺乳動物細(xì)胞中。

而所有的綠色熒光蛋白具有相對較高的亮度，藍(lán)色熒光蛋白通常從微觀的應(yīng)用減少了發(fā)光強(qiáng)度受到影響。 然而，它們用在因其他光譜特性的光學(xué)測定法。EBFP（增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白），通過多輪突變wtGFP構(gòu)成。 第一個(gè)（Y66H）跳過從綠色發(fā)光峰的藍(lán)色光譜。 多個(gè)突變，隨后，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有最大激發(fā)，在380nm處，并在發(fā)光最大值位于448納米。 這些光譜特性使其成為EGFP在FRET徠卡顯微鏡的合作伙伴。 最近的藍(lán)色熒光蛋白具有較高的量子產(chǎn)率和更好的耐光性是石青，SBFP2和EBFP2。 一個(gè)有前途的EBFP繼任者是一個(gè)名為天狼這成為由于其極高的耐受性pH值（pH值從3-9穩(wěn)定）和其是用最短的發(fā)射波長至今的熒光蛋白信譽(yù)流行的一種蛋白質(zhì)。

第二個(gè)“藍(lán)色”類的GFP變異體是由青色熒光蛋白的形成： 國家重點(diǎn)計(jì)劃 。 酪氨酸與色氨酸（Y66W）和進(jìn)一步的遺傳改變的置換導(dǎo)致具有改善的亮度和光熒光染料。 這ECFP具有雙峰的激發(fā)和發(fā)射光譜在433/445 nm 和475/503 nm納米。 亮度是只有大約40％的該綠色熒光蛋白。 一個(gè)突出的ECFP變體是蔚藍(lán) ，它具有更高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率。 它比ECFP更亮的1.5倍，并用作與YFP FRET的一個(gè)伙伴。

甲GFP的突變不直接改變中的發(fā)色團(tuán)的三個(gè)中心氨基酸之一導(dǎo)致黃色熒光蛋白的升高。YFPs具有由酪氨酸（T203Y）交換一個(gè)共同的蘇氨酸，在位置203。 這種氨基酸是β桶的一部分，并位于靠近所述發(fā)色團(tuán)。 相比于綠色熒光蛋白，激發(fā)和發(fā)射屬性已被轉(zhuǎn)換到更長的波長與激發(fā)和發(fā)射最大值在514納米和527納米（EYFP）。EYFP的一個(gè)特征是它的pH值敏感性。 在pH6.5 EYFP只有約50％的熒光，這并不總是一個(gè)缺點(diǎn)。 當(dāng)涉及到pH測量（如囊泡，內(nèi)體等），EYFP，可作為一個(gè)指標(biāo)。 有趣的是，另外的突變（Q69M）開發(fā)出一種更好的酸穩(wěn)定性，并顯著改善了亮度（比EGFP亮的75％）。 這種蛋白質(zhì)，它仍具有光穩(wěn)定性較差相比，EGFP，被稱為黃水晶 。 另一個(gè)YFP的突變體（F46L）呈顯著更快的成熟速度并且還改進(jìn)的pH值電阻。 這種蛋白質(zhì)被命名為金星 ，是一種常見的FRET受體與蔚藍(lán)。

從珊瑚蟲熒光蛋白

正如人們可以從第一部分看到，大多數(shù)的FP，來自水母答來 維多利亞發(fā)射光中的藍(lán)色到黃色的光譜。 紅色熒光蛋白的缺失。 俄羅斯科學(xué)家Sergey A. Lukyanov封閉的差距時(shí)，他發(fā)現(xiàn)的FP的珊瑚蟲。 紅色的FP具有比其他的一大優(yōu)勢，因?yàn)樵诩?xì)胞中的紅色光譜少得多的自體熒光。 此外，他們通過較長的波長，這是很好的活細(xì)胞興奮。 較短波長的光確實(shí)給標(biāo)本遠(yuǎn)遠(yuǎn)更大的傷害。 珊瑚蛋白的過度水母蛋白的另一個(gè)一般性的優(yōu)點(diǎn)是在37℃下它們的有效的成熟。 而A. 維多利亞 GFP和衍生物不得不被遺傳修飾，以正確的方式折疊，珊瑚蟲綱蛋白成熟而不分子工程的必要性。 這可能是由于其生境的溫暖水溫。

• 

• 圖2：紅色熒光蛋白的分子結(jié)構(gòu)

發(fā)現(xiàn)在珊瑚蟲最常用的FP的第一和靜止1是紅色熒光蛋白 。 這個(gè)名字是從?？?em>香菇芨而得。 紅色熒光蛋白具有最大激發(fā)，在558 nm和583 nm的發(fā)射峰。 然而，第一欣快停滯時(shí)結(jié)構(gòu)信息發(fā)布。 紅色熒光蛋白maturates遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于水母的FP和具有中間色團(tuán)的階段。 這一階段發(fā)出的光在綠色光譜和成因等FPS重疊。如已經(jīng)在GFP節(jié)所提到的，紅色熒光蛋白也有另一個(gè)問題。 紅色熒光?？鞍资且环N專性四聚體的傾向，以形成低聚物。 這可導(dǎo)致關(guān)于融合蛋白的定位和功能的誤解。 在一般的珊瑚蟲的FP具有相似的結(jié)構(gòu)，以該多管水母FP的。 發(fā)色是藏在β桶結(jié)構(gòu)，具有4納米×3納米（高×直徑）的大小。 不同之處在于，在珊瑚蟲β桶（圖2）的多橢圓形外觀。

與此同時(shí)，以綠色熒光蛋白“進(jìn)化”，研究人員開始修改原來的紅色熒光蛋白，以克服其結(jié)構(gòu)性缺陷。 第二紅色熒光蛋白產(chǎn)生- 的DsRed2 -具有減小的寡聚物形成趨勢和更快的成熟速度，減少綠色發(fā)光的中間階段。 進(jìn)一步誘變導(dǎo)致了紅色的FP其中已完全喪失其四聚體狀態(tài)，但也喪失了一些它的量子產(chǎn)率（的DsRed2的25％）。 錢學(xué)森等人的這項(xiàng)工作。 是第一單體紅色熒光蛋白，因此被稱為mRFP1。

這mRFP1然后起點(diǎn)創(chuàng)立一組六單體的FP統(tǒng)稱為“mFruit”的。 他們的個(gè)人名得自其發(fā)光色：mHoneydew，mBanana，魔橙，mTangerine，mStrawberry和mCherry mCherry是最有用的，這些FP的，具有50％的該綠色熒光蛋白的亮度發(fā)射光中的610納米范圍內(nèi)。

最亮的FP到目前為止是mFruit派的追隨者，并具有名稱tdTomato。 只要它被遺傳改變，dTomato是一種專性二聚體。 但二聚化被避免通過將兩個(gè)二聚化的伙伴在一個(gè)分子。 兩dTomato單元由一個(gè)12個(gè)氨基酸的接頭偶聯(lián)，產(chǎn)生串聯(lián)二聚體的FP tdTomato具有發(fā)射最大值在581納米和在最高的區(qū)域中的光穩(wěn)定性。

發(fā)射光譜，進(jìn)一步移入遠(yuǎn)紅光區(qū)域（630納米- 700納米）已創(chuàng)建另一個(gè)mFruit后繼時(shí)mPlum是mFruit構(gòu)件與任何mFruit蛋白質(zhì)在649 nm的最深的紅色發(fā)光。

科學(xué)地使用綠色熒光珊瑚蟲綱的蛋白質(zhì)的量是非常小的，這是不令人驚奇鑒于公知的，用戶友好的A的情況的維多利亞 GFP。 顯然，人們并沒有看到任何必要建立一個(gè)新的綠色熒光蛋白。 不過也有一些，比如從石珊瑚Galaxeidae，Azami綠色明亮的熒光蛋白。 其序列同源性與綠色熒光蛋白是有趣小于6％。

一個(gè)珊瑚蟲綱FP這對深部組織成像的高影響Katushka。 對招標(biāo)書的E.未來應(yīng)用誘變 ?？?/em> ，Katushka被鑒定為具有發(fā)射最大值在635納米和所有的深紅色熒光蛋白的最高亮度級一種二聚體蛋白質(zhì)。 Katushka的單體形式被稱為mKate并具有較高的亮度，供給以后，產(chǎn)生mKate2。

總之，所有這些今天用于顯微術(shù)，熒光蛋白是來自于原始的海洋生物。 表1包括最重要的那些連同像激發(fā)和發(fā)射最大值，耐光性，量子產(chǎn)率和亮度及其相關(guān)的光譜特性。

展望

什么被證明是一個(gè)非常有趣的故事是由脊椎動物表達(dá)了FP的發(fā)現(xiàn)。 文昌魚，一條小魚般的海洋脊索動物，產(chǎn)生AmphiGFP在其前側(cè)。 那個(gè)FP的序列分析預(yù)測一個(gè)典型的β桶結(jié)構(gòu)，似乎是相關(guān)的橈足類Pontellina plumata的CopGFP（甲殼綱）。 這一發(fā)現(xiàn)表明，熒光的現(xiàn)象并不限于原始的無脊椎動物，但也可以在更高的進(jìn)化階段動物中發(fā)現(xiàn)。 此外，這一發(fā)現(xiàn)表明熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)，處理和增強(qiáng)這仍然是研究的熱門話題的持續(xù)的過程。 這一事實(shí)證實(shí)的重要性和熒光蛋白在近期和未來生命科學(xué)研究的高沖擊。

熒光蛋白的光譜特性

表1：熒光蛋白
Ex：激發(fā)波長峰值（nm） 

Em：發(fā)射波長峰值（nm）

MW：分子量 
QY：量子產(chǎn)率 
BR：亮度; 消光系數(shù)*量子產(chǎn)率/ 1000 
PS：耐光性; 時(shí)間以50％的亮度（秒）