任何常規(guī)光學(xué)顯微鏡的配置，物鏡是在確定圖像的信息內(nèi)容的系統(tǒng)中最關(guān)鍵的部分。 精細(xì)標(biāo)本細(xì)節(jié)的對(duì)比度和分辨率，其中的信息可以被獲得的樣品內(nèi)的深度，和圖像領(lǐng)域的橫向范圍都是由物鏡的、用于觀測(cè)的具體條件下的性能確定的設(shè)計(jì)。 額外的要求是在共聚焦掃描技術(shù)對(duì)物鏡，在這個(gè)關(guān)鍵的成像組件也可作為照明聚光鏡和經(jīng)常需要進(jìn)行高精度在很寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)和在非常低光水平，不引入不可接受的圖像退化的噪聲。

無(wú)論任何其他系統(tǒng)組件的功能，沒(méi)有信息可以被添加到圖像，不是最初的物鏡捕獲。 在成像路徑一定的中間組件可以執(zhí)行校正功能，但它們的主要性能要求是降低物鏡受到盡可能少的基本圖像信息。 傳統(tǒng)上，一個(gè)特定的應(yīng)用程序在物鏡選擇考慮的首要因素已經(jīng)被放大，無(wú)論是干燥或浸泡的設(shè)計(jì)要求，與透鏡系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。 新的成像技術(shù)，通過(guò)技術(shù)改進(jìn)激光器驅(qū)動(dòng)，熒光染料的發(fā)展，新的樣品標(biāo)簽的能力，以及不斷改進(jìn)的光學(xué)顯微鏡的生產(chǎn)廠(chǎng)家，具有顯著增強(qiáng)在某些研究領(lǐng)域的進(jìn)展。 這是在細(xì)胞和分子生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域尤其如此，和激光共聚焦顯微鏡結(jié)合熒光技術(shù)已被廣泛地依賴(lài)作為一種研究工具。

圖1給出了一個(gè)高性能的物鏡專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于在光譜的可見(jiàn)光和紅外區(qū)的激光照明。物鏡 是60X平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡水浸泡（平場(chǎng)）模型，這是波長(zhǎng)范圍從450至1100納米的修正。 這一物鏡的有用的應(yīng)用程序之間的同步熒光法和微分干涉對(duì)比（ DIC ）無(wú)色差的可見(jiàn)熒光和紅外DIC圖像之間的觀察。物鏡 上也裝有一個(gè)校正環(huán)，使玻璃蓋的厚度和球面像差的成像時(shí)，深部組織內(nèi)或通過(guò)水溶液還原波動(dòng)調(diào)整。 球形和色差在400-700納米區(qū)域的像差校正，也可用類(lèi)似的物鏡，如模型設(shè)計(jì)的紫外成像下降到350納米的。 后者的物鏡的幾個(gè)版本（見(jiàn)圖2）進(jìn)行校正，使紫外光的激發(fā)下，藍(lán)色發(fā)射到同一個(gè)焦點(diǎn)為可見(jiàn)光，從而實(shí)現(xiàn)真正的共聚焦成像的整個(gè)視場(chǎng)。

放置在物鏡在共聚焦儀器的總體要求是類(lèi)似于那些在其他關(guān)鍵顯微鏡的應(yīng)用，盡管不斷增長(zhǎng)的需求的新技術(shù)所帶來(lái)的更常見(jiàn)的比以往的方法這些透鏡系統(tǒng)的性能極限。 某些應(yīng)用程序的特定的局限性表明了其他物鏡的特性可能是一樣重要，甚至更重要，比那些傳統(tǒng)上被認(rèn)為是最重要的。 為了滿(mǎn)足目前有前途的技術(shù)的基本要求，制造商已經(jīng)推出了專(zhuān)門(mén)針對(duì)這些方法的優(yōu)化性能的新型光學(xué)。 高數(shù)值孔徑的發(fā)展，高度校正浸水物鏡是響應(yīng)于在活細(xì)胞和組織的研究急劇增加的一個(gè)例子，它是通過(guò)在含水介質(zhì)中進(jìn)行的必要性。 這是可能的，在激光共聚焦顯微鏡的具體要求，將導(dǎo)致光學(xué)的發(fā)展，不嚴(yán)格正確的一個(gè)或一個(gè)以上的分辨率影響畸變實(shí)現(xiàn)其他的設(shè)計(jì)物鏡，聚焦性能是更重要的青睞。 通常討論的例子是在活細(xì)胞研究的較高的光子收集效率的需要，這可能為物鏡，犧牲一定的像差校正以最大限度地提高透光率發(fā)展的激勵(lì)，尤其是在關(guān)鍵的熒光發(fā)射波長(zhǎng)。

在光學(xué)系統(tǒng)的分辨率是普遍接受的是兩種試樣的功能，使他們能夠區(qū)分為最終的圖像分離之間的最小距離。 在一個(gè)指定的對(duì)比度，視覺(jué)識(shí)別所需的基礎(chǔ)定義，分辨率可以量化為一個(gè)光波長(zhǎng)的函數(shù)（ λ ）和數(shù)值孔徑（na ）的光學(xué)系統(tǒng)。 之間的衍射波前干涉圖像平面產(chǎn)生的艾里斑的光強(qiáng)分布，其直徑（ D ）是由下面的公式，在理想的衍射受限系統(tǒng)：

著名的瑞利準(zhǔn)則考慮兩個(gè)相同點(diǎn)難以辨別時(shí)，由艾里斑直徑的一半分離。 因此，通風(fēng)的半徑（ R ）是等效的橫向分辨率，并通過(guò)修改前面的方程定義。 當(dāng)熒光被利用，物鏡函數(shù)作為聚光鏡和物鏡，因此在下面的表達(dá)，na 代表物鏡的數(shù)值孔徑：

衍射的限制，導(dǎo)致強(qiáng)度的橫向再分配從對(duì)象到通風(fēng)模式也產(chǎn)生散焦沿著光軸，從而改變圖像的點(diǎn)的大小和形狀。 三維強(qiáng)度的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)描述的強(qiáng)度分布和代表轉(zhuǎn)移標(biāo)本信息的圖像平面的光學(xué)系統(tǒng)的性能。 一系列的光學(xué)像差的透鏡系統(tǒng)的特征，以及任何不受物鏡設(shè)計(jì)或補(bǔ)償由另一個(gè)光學(xué)元件校正將改變代表圖像中的每個(gè)樣本點(diǎn)的強(qiáng)度分布，降低相對(duì)于理想衍射性能有限的圖像。 在激光共聚焦顯微鏡應(yīng)用的潛在異常的相對(duì)重要性必須在物鏡選擇的技術(shù)考慮。 在物鏡設(shè)計(jì)和性能的主要因素，因?yàn)樗鼈兩婕熬唧w的共聚焦顯微鏡，在下面的章節(jié)中討論。

目前，應(yīng)用最廣泛的生物應(yīng)用共聚焦顯微鏡配置采用了計(jì)算機(jī)控制的掃描系統(tǒng)，使照明激光束聚焦，通過(guò)物鏡的，在一個(gè)固定的標(biāo)本。 這是被稱(chēng)為 離軸 激光共聚焦掃描因?yàn)閽呙韫馐D(zhuǎn)的光軸的每一側(cè)并利用物鏡元件周?chē)貐^(qū)。 早期實(shí)現(xiàn)在光學(xué)顯微鏡掃描技術(shù)的應(yīng)用 軸 掃描的激光束保持固定在光軸與試樣階段或物鏡進(jìn)行掃描。

雖然在原則上兩種掃描方法可以產(chǎn)生相似的結(jié)果，以選擇最佳的性能物鏡的要求是明顯不同，在軸和離軸照明掃描，并考慮發(fā)射熒光收集的物鏡也不同。 三分之一掃描式利用紡絲 尼普科夫 磁盤(pán)掃描大量的照明點(diǎn)在試樣不移動(dòng)光源或顯微鏡階段。 雖然這種方法被廣泛應(yīng)用在半導(dǎo)體行業(yè)，可以允許實(shí)時(shí)反射光聚焦的觀看，這是不常見(jiàn)的應(yīng)用于生物儀器。 尼普科夫系統(tǒng)可能在活細(xì)胞的調(diào)查，然而變得越來(lái)越重要，因?yàn)樗麄兊臐摿?，以減少細(xì)胞損傷與配置采用高強(qiáng)度的激光源。

透鏡像差影響的物鏡表現(xiàn)可以分為兩類(lèi)，包括那些非色（不變的波長(zhǎng)），和色差，這是依賴(lài)于波長(zhǎng)。 色差是任何 橫向色差 或 縱向色差 ，和波長(zhǎng)獨(dú)立組包括 球形的 畸變， 昏迷 ， 散光 ， 場(chǎng)曲率 ，和 失真 。 色差和球面像差的影響整個(gè)圖像領(lǐng)域，而在離軸區(qū)的殘余像差更普遍。 色差和球面像差（見(jiàn)圖3）是最有可能的聚焦性能的影響。 一般來(lái)說(shuō)，色差不能被修改的程序，必須通過(guò)光學(xué)元件的設(shè)計(jì)處理。 其他文物，尤其是球差，通常是加劇了物鏡的或不匹配的光學(xué)元件引入的不當(dāng)使用，但可以減少或補(bǔ)償后的適當(dāng)?shù)募夹g(shù)或與該光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)整。

球面像差

球差是非的色差，是最重要的聚焦性能，是球面透鏡組件，使軸和周?chē)饩€(xiàn)被集中在連續(xù)的平面性的一種表現(xiàn)。 不同程度的折射光線(xiàn)路徑通過(guò)不同的鏡頭帶結(jié)果中的一個(gè)點(diǎn)源的聚焦圖像模糊，并產(chǎn)生一個(gè)不對(duì)稱(chēng)的強(qiáng)度變化的上方和下方焦平面。 在所有的現(xiàn)代物鏡，校正球面像差視覺(jué)上察覺(jué)不到的水平，如果指定的操作變量為物鏡的設(shè)計(jì)完全滿(mǎn)足。 不幸的是，存在幾種可能性，在實(shí)踐中允許從物鏡的光學(xué)設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，并引起球面像差。 由于球面像差只能精確規(guī)定的距離關(guān)系的物鏡和標(biāo)本和圖像平面之間的適當(dāng)修正，工件可以不經(jīng)意地介紹，如果物鏡指定的管長(zhǎng)度不能維持。 這如果是用在有其他比所需的管的長(zhǎng)度在一個(gè)有限的校正系統(tǒng)顯微鏡發(fā)生，或由光學(xué)元件引入，如過(guò)濾器，為會(huì)聚光束路徑在這樣一個(gè)系統(tǒng)。

球面像差的最佳修正需要認(rèn)真注意的成像介質(zhì)的物鏡外，這是另一個(gè)潛在的性能退化的來(lái)源。物鏡 特性是由設(shè)計(jì)和不定會(huì)適應(yīng)的操作條件范圍內(nèi)（以校正鋌提供調(diào)整除外）。 這可以增加顯著的球面像差的因素是質(zhì)量差的浸油的物鏡和標(biāo)本之間，非標(biāo)準(zhǔn)的蓋玻璃的厚度，樣品安裝介質(zhì)，和試樣本身。 任何物質(zhì)進(jìn)入和樣品之間的物鏡鏡頭前表面的成像系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分。 在高數(shù)值孔徑的堅(jiān)持的物鏡設(shè)計(jì)的要求變得更加重要。 玻璃蓋的厚度和折射率可以提高球面像差的變化，特別是“干”（非浸泡）物鏡。 高數(shù)值孔徑的干燥的物鏡一般是專(zhuān)為一個(gè)0.17-mm玻璃蓋的厚度的最佳性能，具有標(biāo)本直接安裝在與玻璃接觸。

允許的球面像差的校正時(shí)，非標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片厚度時(shí)，很多物鏡都配備了可調(diào)校正環(huán)，可以設(shè)置一系列的厚度設(shè)置。 校正環(huán)通過(guò)翻譯內(nèi)部透鏡組來(lái)改變物鏡焦距。 即使一個(gè)正確的厚度蓋是用玻璃，一層玻璃和試樣之間的介質(zhì)安裝存在偏離理想的光的情況下，將增加的球面像差的程度。 校正環(huán)也可以被用來(lái)減少由這種性質(zhì)的折射率變化引起的球面像差，在激光共聚焦顯微鏡會(huì)降低強(qiáng)度在針孔和深度減少歧視由于軸向焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移。

油浸式物鏡通常是優(yōu)化使用一個(gè)0.17-mm厚度在指定波長(zhǎng)的折射率1.518的玻璃罩，和浸油的精確定義的折射率。 通過(guò)對(duì)玻璃蓋和沉浸介質(zhì)指定的操作條件下，球面像差可以通過(guò)波長(zhǎng)為幾個(gè)值的物鏡設(shè)計(jì)校正（取決于物鏡的類(lèi)型）。 之間的匹配的每種材料的折射率在光路中的重要性，從試件和安裝中物鏡鏡頭前的元素，在歷史上一個(gè)最棘手的成像條件，特別是在試圖達(dá)到高分辨率的生物標(biāo)本。 亞細(xì)胞成分的折射率是大大低于常規(guī)浸漬介質(zhì)，在許多情況下，這些折射率是不確定的，改變整個(gè)試樣。 即使在固定材料，安裝介質(zhì)折射率通常是不相同，可用浸泡油。

活細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)過(guò)程的研究，這是培養(yǎng)并維持生理鹽水，油和水的折射指數(shù)的結(jié)果對(duì)油浸物鏡性能的一個(gè)關(guān)鍵限制的不匹配。 主要的問(wèn)題是，高數(shù)值孔徑的油浸物鏡的潛力是不是由于水的折射率之間的不匹配的實(shí)現(xiàn)（1.33），浸泡油（約1.5）。 在共聚焦顯微鏡的應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵因素是提高熒光成像和厚的樣品的三維表示，和球面像差時(shí)引入的油浸物鏡是限制水標(biāo)本深度為中，可接受的圖像可以得到。 在一般情況下，高數(shù)值孔徑的油浸物鏡是設(shè)計(jì)用來(lái)在圖像平面的不超過(guò)15至20微米的玻璃蓋下。 當(dāng)應(yīng)用于水的標(biāo)本，然而，球差引起的在水玻璃蓋接口可以達(dá)到相當(dāng)?shù)乃皆谏疃葹?0微米。 作為一個(gè)例子，點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，如圖4所示出增加的程度球差發(fā)生平場(chǎng)復(fù)消色差透鏡油浸物鏡在穿透深度范圍從零到8微米。

在從水生物標(biāo)本采集三維數(shù)據(jù)，利用激光共聚焦熒光顯微鏡技術(shù)的興趣被廠(chǎng)家引進(jìn)一批高數(shù)值孔徑的主要誘因，高度校正浸水物鏡。 球面像差是活細(xì)胞的共聚焦研究的一個(gè)主要的光學(xué)限制時(shí)的油浸物鏡的影響，和成比例增加的深度觀察到水性介質(zhì)和可變的子細(xì)胞成分（見(jiàn)圖4）。 對(duì)成像的負(fù)面影響包括對(duì)比度和信號(hào)強(qiáng)度，由于在發(fā)射的熒光強(qiáng)度到達(dá)探測(cè)器的針孔的分?jǐn)?shù)減少損失，微小的標(biāo)本特征分辨率損失，并減少 Z 軸的定位精度，從而影響的三維圖像重建的完整性。 利用水浸的物鏡成像時(shí)，試樣在水介質(zhì)中顯著的深度下方的玻璃蓋，球面像差的降解是可以避免或減少，使激光共聚焦技術(shù)的充分實(shí)現(xiàn)的好處。 能夠在水介質(zhì)中超過(guò)200微米的深度收集準(zhǔn)確的三維數(shù)據(jù)具有長(zhǎng)工作距離浸水物鏡。

一個(gè)油浸物鏡，無(wú)論光學(xué)矯正的程度，是不能成像水浸泡標(biāo)本的最佳選擇。 最佳的圖像質(zhì)量可能是這個(gè)組合只為在與蓋玻璃直接接觸標(biāo)本地區(qū)。 在更大的深度，球面像差，降低對(duì)比度和分辨率和減少圖像的亮度，在某種程度上，聚焦的信噪比大大降低的影響。 使用一個(gè)高度校正浸水的物鏡是降低引起的球面像差成像時(shí)，在大的距離，在水介質(zhì)中的最佳解決方案。 雖然設(shè)計(jì)的前透鏡元件直接浸入試樣中可用的物鏡，重點(diǎn)是采集三維數(shù)據(jù)所需的變化可能產(chǎn)生的序列中的圖像之間的試樣不良的運(yùn)動(dòng)。 為了避免這個(gè)標(biāo)本運(yùn)動(dòng)時(shí)物鏡試樣的距離是變化的，一個(gè)玻璃蓋必須用在大多數(shù)情況下。

一些最近推出的高數(shù)值孔徑水物鏡將調(diào)整項(xiàng)圈提供球面像差校正的變量，如在蓋玻片厚度波動(dòng)引起的。 這種類(lèi)型的校正環(huán)補(bǔ)償在生理介質(zhì)和細(xì)胞成分的折射率的差異也是有用的，和折射率隨溫度和溶質(zhì)濃度的變化。 由于這有助于引起的球面像差的各種因素，可調(diào)節(jié)的校正是聚焦應(yīng)用物鏡的一種理想的功能，即使在最佳厚度的玻璃蓋采用。

離軸像差

常見(jiàn)的光學(xué)像差簡(jiǎn)稱(chēng) 昏迷 主要影響的點(diǎn)源，遠(yuǎn)離光軸，產(chǎn)生條紋狀的圖像點(diǎn)的徑向畸變，在視場(chǎng)角的嚴(yán)重程度增加（見(jiàn)圖5）。 昏迷是有點(diǎn)類(lèi)似于球面像差，可能是由同一因素引起的。 這是一般的像差校正在現(xiàn)代光學(xué)系統(tǒng)中的透鏡元件的適當(dāng)利用，和物鏡中，昏迷和球面像差被淘汰被分類(lèi)為 消球差 。 因?yàn)榛杳允且粋€(gè)離軸像差，它具有共聚焦激光掃描系統(tǒng)的意義，它通常利用離軸光束的路徑，但不與樣品掃描一個(gè)因子（軸）的共聚焦顯微鏡。

幾何畸變的一些額外的類(lèi)型可能對(duì)共焦物鏡性能的顯著，因?yàn)樵趨^(qū)域的圖像場(chǎng)遠(yuǎn)離中心的所有的都更加明顯，他們更可能影響到在激光掃描共聚焦系統(tǒng)的性能。 共聚焦成像的光學(xué)要求是，只有高度校正光學(xué)系統(tǒng)有可能充分履行，和顯著的幾何像差通常會(huì)被最小化的物鏡從這類(lèi)。 然而，它是有益的，要知道這些畸變和潛在的問(wèn)題，他們可能會(huì)引入時(shí)，物鏡選擇，尤其是如果特定的性能特點(diǎn)是以犧牲另一個(gè)變量的優(yōu)化可能在一個(gè)特定的應(yīng)用程序是更重要的。

未校正 散光 可以減少圖像的清晰度和對(duì)比度，強(qiáng)度，增加的影響，從光軸的距離（圖5）。 像散的圖像點(diǎn)的幾何形狀可能考慮兩個(gè)正交的平面，斷面圖像的波前通過(guò)定義。 飛機(jī)（切向和矢狀面）在像散系統(tǒng)可能有不同的焦距和表現(xiàn)出不同的半徑為完全對(duì)稱(chēng)的樣本點(diǎn)。 這種畸變的結(jié)果在對(duì)稱(chēng)的點(diǎn)，位于離軸是徑向或切向伸長(zhǎng)的圖像特征，根據(jù)焦點(diǎn)。 當(dāng)最好的重點(diǎn)是選擇在兩個(gè)極端之間的一種折衷的位置，由此產(chǎn)生的通風(fēng)盤(pán)是非對(duì)稱(chēng)的，導(dǎo)致圖像退化。 散光可導(dǎo)致低中心的元素在一個(gè)低質(zhì)量的或損壞的物鏡，是顯微鏡的光路中增加了其他失調(diào)。

一個(gè)透鏡性質(zhì)描述為 場(chǎng)曲率 或 野平坦度 是在許多關(guān)鍵的測(cè)量和高分辨率成像應(yīng)用的重大意義，例如半導(dǎo)體檢驗(yàn)，雖然在大多數(shù)生物共聚焦的調(diào)查，它不是一個(gè)嚴(yán)重的限制。 簡(jiǎn)單球面透鏡聚焦圖像點(diǎn)來(lái)自不同地區(qū)在一個(gè)平坦的試樣在彎曲圖像的表面，這反映了透鏡表面的形狀。 平面圖像平面不符合焦點(diǎn)曲面，其結(jié)果是該領(lǐng)域的中樞和外周區(qū)不能同時(shí)把焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)。 更復(fù)雜的透鏡組成的透鏡元件的設(shè)計(jì)，多個(gè)團(tuán)體，是必要的正確的這場(chǎng)曲率和擴(kuò)大的焦點(diǎn)中心區(qū)的大小。物鏡 指定為 平場(chǎng) 或平場(chǎng) 糾正光學(xué)產(chǎn)生從中心到邊緣具有清晰度廣泛的適用領(lǐng)域，以最小的場(chǎng)曲，在中間圖像平面。 在最后的圖像平面場(chǎng)的平整度也依賴(lài)于中間的光學(xué)元件，包括顯微鏡目鏡。

現(xiàn)代的物鏡是能夠產(chǎn)生清晰圖像領(lǐng)域是大約兩倍，在早期的物鏡的可用字段直徑。 專(zhuān)門(mén)的抗反射涂層，使這一成就的技術(shù)創(chuàng)新中，雖然增加了光的復(fù)雜性降低的光傳輸和更大的成本。 在激光共聚焦生物應(yīng)用厚截面或活細(xì)胞成像，非平場(chǎng)物鏡的使用可能會(huì)容忍由于物鏡產(chǎn)生的截面曲率相對(duì)微不足道的其他因素的不確定性對(duì)精確的試件形狀。 如果其他光學(xué)畸變校正，在三維數(shù)據(jù)集的任何潛在的失真可以糾正輕微場(chǎng)曲率引起的。 在許多情況下，奈奎斯特采樣條件可能只需要物鏡字段的中央部分，利用。

從中心到邊緣的圖像場(chǎng)放大產(chǎn)生的幾何非線(xiàn)性 失真 試件的特點(diǎn)，使他們真正的三維輪廓被扭曲的圖像。 如果存在的話(huà)，這種作用是很容易觀察到，當(dāng)交叉線(xiàn)正交組的成像，而不是出現(xiàn)在整個(gè)圖象場(chǎng)直，線(xiàn)可以是向外或向內(nèi)彎曲的區(qū)域遠(yuǎn)離磁場(chǎng)中心。 這兩種類(lèi)型的失真通常被稱(chēng)為 桶 和 枕形失真 失真，分別。 是場(chǎng)曲率的情況下，少量的幾何失真通常在生物學(xué)中的應(yīng)用并不是很重要的，但可在材料科學(xué)研究至關(guān)重要如果缺陷分析和精確測(cè)量的物鏡是。

色差

色 畸變是由兩個(gè)基本的光學(xué)現(xiàn)象，具有波長(zhǎng)依賴(lài)性引起，產(chǎn)生不同類(lèi)型的圖像缺陷。 一種類(lèi)型的色差的事實(shí)是，所有的光學(xué)玻璃的折射率隨波長(zhǎng)而引起的，而在放大率隨波長(zhǎng)變化的第二個(gè)結(jié)果。 折射率與波長(zhǎng)的依賴(lài)關(guān)系（通常稱(chēng)為 色散 ）產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的光的有效焦距差。 因此，對(duì)于一個(gè)由一個(gè)單一的玻璃組成的簡(jiǎn)單的鏡頭，只有一個(gè)波長(zhǎng)（或一個(gè)窄的波長(zhǎng)范圍內(nèi)）可以精確地聚焦在一個(gè)特別關(guān)注的背景圖像平面。 其它波長(zhǎng)的光將集中或接近或遠(yuǎn)離鏡頭。 由此產(chǎn)生的光譜色散沿著光軸被稱(chēng)為 縱向色差 ，或者， 軸向色差 （見(jiàn)圖6）。 為一個(gè)點(diǎn)源成像的光學(xué)軸，折射率的漸變引起藍(lán)色的光被聚焦的最近的鏡頭，波長(zhǎng)較長(zhǎng)的會(huì)聚在重點(diǎn)逐步遠(yuǎn)離透鏡。 的像差，如不加以糾正，可以看成是不同顏色的條紋圖像時(shí)失焦的最好的視覺(jué)焦點(diǎn)的兩側(cè)。

未校正的縱向色差在用于激光共聚焦顯微鏡物鏡可以產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，尤其是當(dāng)成像兩種或兩種以上的熒光團(tuán)，這取決于能力證明在幾個(gè)波長(zhǎng)的熒光共定位。 當(dāng)多個(gè)熒光團(tuán)，縱向色差引起的各種激光激發(fā)光束可以聚焦在樣品中的不同點(diǎn)，和類(lèi)似的結(jié)果在不同的發(fā)射波長(zhǎng)收集非重合點(diǎn)。 這種畸變對(duì)建立的熒光團(tuán)的準(zhǔn)確位置的可能性 Z -在三個(gè)維度的樣本數(shù)據(jù)生成的方向。

在激光掃描共聚焦技術(shù)，為一個(gè)特定的物鏡色差圖像的完整性的影響的評(píng)估需要的所有因素，確定穿過(guò)針孔，記錄由檢測(cè)器的信號(hào)能量的考慮。 這些因素包括激發(fā)激光發(fā)射譜，每個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射峰和帶寬，和探測(cè)器的光譜靈敏度。 縱向色差校正通常是由具有不同的光學(xué)特性的多個(gè)透鏡元素的組合的物鏡設(shè)計(jì)完成，修正為物鏡，為不同的類(lèi)別分類(lèi)的基礎(chǔ)部分和程度（見(jiàn)下文）。

透鏡的焦距與波長(zhǎng)的變化，從而產(chǎn)生表征縱向色差軸向擴(kuò)散，同時(shí)還負(fù)責(zé)發(fā)生 橫向色差 （見(jiàn)圖6）。 由于放大率是成反比的焦距，焦距與波長(zhǎng)的變化，產(chǎn)生相應(yīng)的放大對(duì)波長(zhǎng)的依賴(lài)。 如果這是不物鏡像差校正，圖像中的鋒利的邊緣，可能被包圍的紅色或藍(lán)色的條紋。 從藍(lán)色波長(zhǎng)成分信號(hào)放大率可能會(huì)有所不同從約1的紅色分量百分之2未校正的物鏡。 當(dāng)在一個(gè)共焦掃描光學(xué)系統(tǒng)，橫向色差可以導(dǎo)致在針孔信號(hào)丟失，因?yàn)榭赡馨l(fā)出的光將拍攝地點(diǎn)是接近或遠(yuǎn)離光軸比真正的試樣的位置，這取決于光的光譜成分。

因?yàn)檫@兩種類(lèi)型的色差是相關(guān)的，物鏡是高度校正縱向色差一般表現(xiàn)出最小的橫向色差和。 采用不同的方法通過(guò)顯微鏡廠(chǎng)家中的光學(xué)性能的影響的各種因素的校正，和系統(tǒng)組件的仔細(xì)匹配是獲得最大校正像差本質(zhì)。 共焦熒光顯微鏡，未校正的橫向色差的結(jié)果在誤差進(jìn)行了映射的熒光發(fā)射不同波長(zhǎng)的位置的縱向變化類(lèi)似的問(wèn)題。

大部分的光學(xué)顯微鏡制造歷史，為物鏡的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)后，所需的物鏡在一個(gè)指定的固定距離的物鏡安裝表面形成一個(gè)真正的圖像，對(duì)應(yīng)于目鏡前焦點(diǎn)平面。 基于物鏡的真實(shí)的中間圖像直接形成的結(jié)構(gòu)稱(chēng)為 有限 系統(tǒng)，和距離的中間圖像被稱(chēng)為 管長(zhǎng)度 的物鏡。 雖然在同一時(shí)間，各廠(chǎng)商的標(biāo)準(zhǔn)有限光學(xué)系統(tǒng)在同一管的長(zhǎng)度和齊焦距離，不同的方法被用來(lái)補(bǔ)償透鏡的像差，而這個(gè)因素必須如果來(lái)自不同制造商的光學(xué)元件組合使用，考慮。 有限的系統(tǒng)可被設(shè)計(jì)為在物鏡提供充分的像差校正，或一個(gè)已知的殘留水平橫向色差可以在物鏡上形成的圖像，這是由目鏡補(bǔ)償。

在 無(wú)限的 光學(xué)系統(tǒng)，光線(xiàn)離開(kāi)物鏡不集中，但保持平行，直到被會(huì)聚在中間圖像平面的 管材 透鏡（有時(shí)稱(chēng)為 特蘭 鏡頭）。 最主要的顯微鏡制造商已經(jīng)開(kāi)發(fā)出無(wú)限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)，這從物鏡的光線(xiàn)的內(nèi)在利益，聚焦于無(wú)限遠(yuǎn)處，是相對(duì)不敏感的附加的光學(xué)元件放置在“無(wú)限空間”之間的物鏡和管透鏡。 雖然管透鏡可以執(zhí)行一些殘余像差校正，在設(shè)計(jì)，提供完整的校正內(nèi)的物鏡性的優(yōu)勢(shì)，與管透鏡光學(xué)中性。 圖7給出了典型的直立和倒置熒光顯微鏡無(wú)限光通路。 雙頭白色箭頭在每個(gè)顯微鏡圖顯示物鏡后孔和管透鏡之間的平行光路。

不同廠(chǎng)家的堅(jiān)持在無(wú)限系統(tǒng)不同的設(shè)計(jì)規(guī)范，包括管透鏡的焦距長(zhǎng)度和無(wú)限的空間。 無(wú)限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)的物鏡是使移動(dòng)以代替顯微鏡的階段，在觀察期間，要求試樣的微妙的操縱應(yīng)用的一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)。 然而，在無(wú)限空間的主要實(shí)踐的好處是，輔助光學(xué)元件，如偏振光分析器，過(guò)濾器，和微分干涉對(duì)比（ DIC ）棱鏡，可以添加未經(jīng)其折射性質(zhì)或厚度主要關(guān)心的。 只要他們有平面平行的表面，添加元素對(duì)圖像質(zhì)量的影響可以忽略不計(jì)的有。 相反，光學(xué)組件不能置于有限校正系統(tǒng)的光路，這是收斂的物鏡和中間圖像平面之間，而不引入圖像移位和其他像差的厚度和折射率不同的添加元素。

在顯微鏡的物鏡的光學(xué)校正

不論一個(gè)有限或無(wú)限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)的應(yīng)用，設(shè)計(jì)了系統(tǒng)的物鏡相結(jié)合的性能標(biāo)準(zhǔn)，必須考慮到在確定的物鏡，將滿(mǎn)足特定成像技術(shù)要求。物鏡 通常分為根據(jù)其光學(xué)矯正度性能類(lèi)別。 作為討論的相對(duì)重要性，各種像差和性能指標(biāo)的影響取決于他們的方式是用物鏡和應(yīng)用的基本要求。物鏡 的最一般的分組通常是基于他們的像差校正的程度，雖然傳統(tǒng)的物鏡類(lèi)別已變得不那么明顯的最近，由于在光學(xué)設(shè)計(jì)和制造技術(shù)的重大進(jìn)展。 大部分的描述性術(shù)語(yǔ)仍然是有效的和廣泛使用的，和所使用的術(shù)語(yǔ)的理解和他們?nèi)绾紊婕暗骄劢沟膽?yīng)用是非常重要的當(dāng)各種可用的物鏡正在評(píng)估。

色差是用于制造透鏡的光學(xué)玻璃由于分散，通常利用相結(jié)合的具有不同色散特性的透鏡元件校正。 傳統(tǒng)上，具有最小的校正色差的物鏡分為 消色差透鏡 （見(jiàn)圖8），通常采用玻璃具有正常色散。 這種類(lèi)型的眼鏡具有折射率隨波長(zhǎng)的近線(xiàn)性下降，包括冠和火石玻璃。 冕玻璃通常具有低的折射率、低色散，在對(duì)比火石玻璃，通常具有高折射率和高色散。 中老年消色差物鏡，兩個(gè)或兩個(gè)以上的這些類(lèi)型的玻璃透鏡元件相結(jié)合，提供色差校正帶來(lái)了紅色和藍(lán)色的光聚焦到一點(diǎn)，也為綠色光的球面像差校正。 現(xiàn)代的消色差物鏡的球面像差通常有額外的校正，和場(chǎng)曲的重要修正。 如果物鏡是糾正延長(zhǎng)平整場(chǎng)整個(gè)圖像域，它是指定平場(chǎng) 消色差透鏡 。 在一般情況下，消色差物鏡傳統(tǒng)的明場(chǎng)觀察是合適的，和顯微攝影和數(shù)碼影像與額外的（ 平場(chǎng) ）場(chǎng)曲率校正。

為了實(shí)現(xiàn)改進(jìn)的色差校正，玻璃類(lèi)型具有反常色散的光譜的一部分是必需的。 在顯示的折射率與紅色和藍(lán)色光譜區(qū)域波長(zhǎng)的非線(xiàn)性變化的眼鏡，色差可以抵消允許多個(gè)波長(zhǎng)的同時(shí)重點(diǎn)。 結(jié)晶螢石是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的材料來(lái)減少未校正二級(jí)光譜負(fù)責(zé)綠色或紫色條紋，邊緣鋒利的邊緣提供合適的光學(xué)性能的表征，獲得消色差圖像。 在各種光學(xué)玻璃的組合，螢石元素提供的能力，正確的色像差的三波長(zhǎng)（顏色）和兩個(gè)球面像差。 此外，這種高度修正物鏡改進(jìn)傳輸特性在紫外線(xiàn)光譜區(qū)。

更近來(lái)的技術(shù)發(fā)展已經(jīng)提供了新的光學(xué)玻璃配方和透鏡成形產(chǎn)生類(lèi)似螢石元件的色散特性，而大多數(shù)制造商生產(chǎn)線(xiàn)的具有光學(xué)校正接近那些最高類(lèi)別（圖8） Fluor 的物鏡的能力。這些物鏡有時(shí)稱(chēng)為 半復(fù)消色差，并且可以或可以不含有螢石的元素，但由于它們的光學(xué)特性的，但卻指定由不同的制造商，其名稱(chēng)為 Fl, PlanFl, Fluor, Plan Fluor, Neofluor，和 Plan Neofluor 。這一類(lèi)的當(dāng)前物鏡是在許多配置中，包括用于與多個(gè)浸沒(méi)介質(zhì)的使用模式可用，并且適合于在明場(chǎng)，熒光，相襯，偏光，和微分干涉對(duì)比使用，以及一些共聚焦和多光子應(yīng)用。

物鏡分類(lèi) 復(fù)消色差透鏡 通常都是那些對(duì)色差和球面像差校正的最高水平（見(jiàn)圖8）。 這些物鏡通常有最高的有效數(shù)值孔徑，對(duì)于一個(gè)給定的放大，和色差和球面像差至少三波長(zhǎng)校正。 隨著畸變幾乎完整的校正，復(fù)消色差的物鏡一般是適用于任何顯微鏡技術(shù)，雖然所有的技術(shù)采用特定的性能要求，必須考慮。 在光學(xué)矯正所表現(xiàn)出的消色差透鏡異常程度的怨恨，因?yàn)樗麄兝梅闯Ｉ⑼哥R元件（通常包括螢石），他們可能不適合某些偏光顯微鏡的應(yīng)用程序或紫外熒光激發(fā)的最佳選擇。 因?yàn)樘烊晃炇w，它可以限制偏光性能降低的最大消光系數(shù)可以實(shí)現(xiàn)的，并且可能包含有機(jī)污染物與不良的熒光性質(zhì)。 除非一個(gè)復(fù)消色差物鏡是專(zhuān)為偏振光，在近紫外光譜區(qū)域，克服的局限性，在螢石物鏡（半復(fù)消色差透鏡）可能提供更好的性能，在某些應(yīng)用。

共聚焦熒光應(yīng)用受到嚴(yán)重限制如果物鏡像差校正不同樣的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，更難以滿(mǎn)足要求時(shí)，使用或多個(gè)熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)之間的差異是大的。 為了實(shí)現(xiàn)最大的檢測(cè)到的光子能量，照明光斑和檢測(cè)區(qū)域的成像在針孔之間必須保持齊焦。 許多物鏡，即使在復(fù)消色差透鏡類(lèi)，不提供紫外激發(fā)熒光技術(shù)結(jié)合適當(dāng)?shù)男Ｕ梢?jiàn)光發(fā)射。 附加的光學(xué)元件可以采用在紫外激光源補(bǔ)償?shù)奈镧R無(wú)法容納在寬波長(zhǎng)范圍，雖然這增加了費(fèi)用和大量的運(yùn)算復(fù)雜度的共焦系統(tǒng)。

高性能水浸的物鏡已經(jīng)最近推出的最主要的制造商，和許多這些物鏡是專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)來(lái)滿(mǎn)足當(dāng)前快速發(fā)展的研究領(lǐng)域提出的要求。 一個(gè)主要物鏡是在生物標(biāo)本共聚焦熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)最佳的性能，包括活細(xì)胞和組織的生理媒體支持。 這是認(rèn)識(shí)到，無(wú)論像差校正納入一個(gè)物鏡的設(shè)計(jì)水平是必要的，額外的像差可以通過(guò)違反設(shè)計(jì)的操作要求引入外部物鏡的光路，這會(huì)降低性能的最佳成分。

新的水浸的物鏡（見(jiàn)圖9）避免這一類(lèi)型中最常見(jiàn)的問(wèn)題，這是折射率之間的不匹配和試樣浸泡媒體。 他們還提供高分辨率和大數(shù)值孔徑的設(shè)計(jì)改進(jìn)的光收集，并有較長(zhǎng)的工作距離。 此外，特別注意的是給定的紫外線(xiàn)波長(zhǎng)的高傳輸，并擴(kuò)大光學(xué)校正從紫外到可見(jiàn)光發(fā)射區(qū)常見(jiàn)的熒光團(tuán)，以維持激勵(lì)和信號(hào)采集共焦條件。 奧林巴斯，例如，提供一系列的專(zhuān)業(yè) W LSM 浸水高數(shù)值孔徑復(fù)消色差（激光共聚焦顯微鏡；參見(jiàn)圖2），這是一個(gè)大的平場(chǎng)校正，和從約340至650納米的延長(zhǎng)復(fù)消色差校正。

專(zhuān)為直接浸泡或水浸的物鏡，具有專(zhuān)業(yè)的陶瓷或聚合物nosecones，可用于活細(xì)胞和生理的研究（圖2）。 這些研究往往需要測(cè)量或其他操作的標(biāo)本，不能做有一個(gè)玻璃蓋。 一般水浸的物鏡是在螢石的范疇，在紫外線(xiàn)和紅外光譜區(qū)具有較高的傳輸，并設(shè)計(jì)了長(zhǎng)工作距離的規(guī)格和插入窄的輪廓（浸漬）在物鏡的鼻子部分。 小角鼻上的物鏡是為了讓附件微電極最大訪(fǎng)問(wèn)標(biāo)本或執(zhí)行其他操作期間觀察。 長(zhǎng)工作距離，這可能與這種風(fēng)格的一些物鏡幾毫米，也提供更大的訪(fǎng)問(wèn)的標(biāo)本。 許多浸物鏡浸泡部分是由陶瓷或其它惰性絕緣材料的電氣隔離和耐化學(xué)性。 他們的特征的組合使得水浸物鏡適合活標(biāo)本共聚焦，多光子電離，和許多其他的成像方法。

除放大，數(shù)值孔徑，和程度的光學(xué)校正的，物鏡的 工作距離 在用于獲取三維標(biāo)本信息共聚焦顯微鏡和其他數(shù)字顯微鏡技術(shù)的特殊意義。 工作距離，物鏡要求的玻璃罩，被定義為玻璃蓋和前透鏡元件的頂面之間的距離在蓋玻璃接觸試樣面關(guān)注的焦點(diǎn)（圖10（b））。 這個(gè)距離是重要的時(shí)候，共焦成像是在不同深度的標(biāo)本，因?yàn)樗鼪Q定了最大侵徹深度，是可以實(shí)現(xiàn)的重點(diǎn)在物鏡接觸玻璃蓋的頂部。 工作距離，因此，限制的范圍內(nèi)沿 Z 軸從樣本數(shù)據(jù)可以收集。

作為一個(gè)例子，與0.20-mm物鏡（200微米）的工作距離可以被聚焦到一個(gè)200微米以下的玻璃蓋的最大深度在物鏡上的蓋玻璃表面接觸。 在一定范圍內(nèi)，工作距離可由光學(xué)設(shè)計(jì)不同，雖然它通常降低放大，數(shù)值孔徑的增加，和光學(xué)校正。 保持大數(shù)值孔徑和高度的長(zhǎng)工作距離的像差校正是通過(guò)簡(jiǎn)單的幾何約束條件，通過(guò)鏡頭的元素和在一個(gè)高度校正的物鏡所需要的數(shù)量施加限制的形狀。 許多現(xiàn)有的物鏡規(guī)格代表成績(jī)顯著的性能改進(jìn)的光學(xué)眼鏡，鏡片涂層的有效實(shí)現(xiàn)，和計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的能力。

事實(shí)上，信號(hào)強(qiáng)度是放大的平方成反比，在共聚焦顯微鏡在優(yōu)化物鏡選擇的影響，在某些情況下，改變各種性能因素的相對(duì)重要性。 一些研究人員認(rèn)為，厚的組織切片成像的亞細(xì)胞成分，它通常是有利的選擇溫和放大的高數(shù)值孔徑的物鏡以浸泡半復(fù)消色差物鏡類(lèi)別獲得最大的光收集。 當(dāng)利用共聚焦掃描系統(tǒng)與電子變焦功能，它采用100倍光學(xué)放大很少是必要的，和高度校正（和高數(shù)值孔徑）40x和60x物鏡可能受益于額外的光收集技術(shù)更適合。

許多流行的技術(shù)，如熒光成像，從根本上受到這樣的低光水平，該光學(xué)系統(tǒng)的傳輸特性是至關(guān)重要的。 只有少數(shù)的光子可用于微小細(xì)節(jié)的標(biāo)本檢測(cè)，并因此在熒光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的傳輸率的一個(gè)相對(duì)較小的差異可以在確定一個(gè)標(biāo)記的特征可探測(cè)的關(guān)鍵。 在某些情況下，物鏡的傳輸性能可能比其他規(guī)格如野平坦度和像差校正的意義更大，這需要額外的鏡頭和涂料，可以增加一個(gè)關(guān)鍵的波長(zhǎng)頻帶的光損耗。 復(fù)消色差校正可能危及其他物鏡的要求，正如前面所討論的關(guān)于偏振光的性能，并降低光傳輸中的紫外或近紫外范圍一直被一個(gè)全像差校正的成本。

在較寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)提高傳輸性能物鏡的同時(shí)還實(shí)現(xiàn)了高水平的像差校正已在共聚焦熒光應(yīng)用尤為重要，許多最近的高性能物鏡，包括水浸泡，已在紫外高傳輸優(yōu)化。 它是在技術(shù)使用波長(zhǎng)考慮物鏡的傳輸性能的重要，這樣的數(shù)據(jù)通常可從物鏡的制造商。 特定的光譜傳輸特性的光學(xué)玻璃組成的確定，采用的水泥復(fù)合透鏡元件之間，和涂層的透鏡表面。 作為透鏡設(shè)計(jì)的復(fù)雜性增加，涂層的透鏡的重要性減少內(nèi)部反射已變得越來(lái)越重要。 早期簡(jiǎn)單的單層涂層大大提高了整體的傳輸，并不斷細(xì)化的專(zhuān)有材料的多層涂層進(jìn)一步使透鏡設(shè)計(jì)師拓展所需波段物鏡傳輸，即使鏡片數(shù)量和物鏡的整體的復(fù)雜性顯著增加。

專(zhuān)業(yè)的技術(shù)被應(yīng)用于細(xì)胞和分子生物學(xué)的問(wèn)題迅速發(fā)展的領(lǐng)域，以及在其他領(lǐng)域，導(dǎo)致了在要求對(duì)光學(xué)成像系統(tǒng)的變化，特別是考慮到顯微鏡物鏡。 生物標(biāo)本的三維調(diào)查在共焦掃描技術(shù)利用的急劇增加是影響產(chǎn)品的商業(yè)開(kāi)發(fā)的一個(gè)主要因素，雖然方法如激光捕獲，多光子激發(fā)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ FRET ），熒光原位 雜交（FISH ），和紅外微分干涉對(duì)比也提出了新的要求。 一些專(zhuān)門(mén)的技術(shù)參數(shù)表明了某些傳統(tǒng)的物鏡的績(jī)效標(biāo)準(zhǔn)可以是至少部分地犧牲為了提高其他更重要的規(guī)格。 在計(jì)算機(jī)輔助透鏡設(shè)計(jì)和光學(xué)玻璃配方的巨大進(jìn)步，除了那些在抗反射涂層技術(shù)，使得能夠滿(mǎn)足許多新的要求，改進(jìn)的光學(xué)導(dǎo)論，很少或沒(méi)有權(quán)衡在傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)顯微鏡。 這些具有更高的數(shù)值孔徑高性能水浸泡的物鏡，增加工作距離，球面像差校正衣領(lǐng)，和增強(qiáng)的紫外線(xiàn)和紅外線(xiàn)傳輸物鏡。

許多現(xiàn)代的物鏡是適合使用在激光共聚焦顯微鏡時(shí)，利用其設(shè)計(jì)規(guī)范的一致性。 對(duì)于許多應(yīng)用程序，以小于全復(fù)消色差校正的物鏡，如螢石類(lèi)半復(fù)消色差透鏡，是作為一個(gè)通用的物鏡，可以在多聚焦技術(shù)的一個(gè)理想的妥協(xié)。 高分辨率的檢測(cè)及與激光掃描共聚焦顯微鏡厚水標(biāo)本的精確三維成像是特別的要求和需要滿(mǎn)足以下所有標(biāo)準(zhǔn)的物鏡：高效熒光收集高數(shù)值孔徑，長(zhǎng)工作距離允許的最大穿透深度，精確的三維重建的平場(chǎng)，低軸向色差的多個(gè)熒光團(tuán)的齊焦，和較低的橫向色差，使多個(gè)熒光圖像的精確配準(zhǔn)，除了高傳輸在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。