徠卡顯微鏡STED樣品制備與快速指南
本指南的目的是作為一個(gè)快速參考指南最常見(jiàn)問(wèn)題關(guān)于樣品的準(zhǔn)備徠卡SP8 TCS發(fā)生的3倍,通過(guò)介紹所需的理論基礎(chǔ) 樣本受激發(fā)射損耗 。 它提供了最常見(jiàn)的信息免疫熒光標(biāo)記技術(shù) , 越來(lái)越多的媒體工作 , 基本質(zhì)量?jī)?yōu)化程序 和 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 。 它還包含一個(gè)詳細(xì)的列表,試劑、抗體和一次性用品經(jīng)常成功地用于超分辨率發(fā)生的顯微鏡。 總之,本指南是為了現(xiàn)在的必要的知識(shí),包括一些提示和技巧,為用戶準(zhǔn)備他們的第一個(gè)超分辨率顯微鏡樣品。
指導(dǎo)的重點(diǎn)設(shè)置 Leica TCS SP8 STED 3X 與592 and 660nm STED激光
受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡是基于熒光共焦成像，其中圖像是通過(guò)掃描形成聚焦光點(diǎn)在感興趣的區(qū)域，并且通過(guò)像素收集的熒光順序像素獲得的超分辨率方法。該技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)有：
橫向分辨率沒(méi)有任何額外的后處理低于50 nm渦流環(huán)室
內(nèi)在的共焦光學(xué)切片，用渦甜甜圈時(shí)，使收購(gòu)約500納米的平面，三維結(jié)構(gòu)，甚至幾十微米深層組織內(nèi)的
使用z軸分辨率低于130 nm甜甜圈
到水平和分辨率提高空間分布于感興趣的樣品/應(yīng)用單獨(dú)匹配的能力
每秒幾個(gè)圖像的快速圖像采集
通過(guò)使用熒光蛋白或其他熒光標(biāo)記活的成像能力
能夠選擇的熒光在很寬的光譜范圍由幾個(gè)不同的激光器受激發(fā)射損耗在一臺(tái)儀器啟用
步驟1:選擇樣本
受激發(fā)射損耗可以在一個(gè)大的各種樣品的應(yīng)用，從單一培養(yǎng)的扁平細(xì)胞，組織切片，以整體動(dòng)物，如線蟲(chóng)（線蟲(chóng)）和昆蟲(chóng)（果蠅）。盡管如此幾點(diǎn)應(yīng)該加以考慮。受激發(fā)射損耗應(yīng)用專門(mén)開(kāi)發(fā)的受激發(fā)射損耗100X /1.4油浸物鏡，其中有90微米的工作距離。因此，所觀察到的結(jié)構(gòu)應(yīng)該是至多80微米遠(yuǎn)離護(hù)罩玻璃，但優(yōu)選在20μm的范圍內(nèi)以獲得最佳性能。另外，為了達(dá)到最佳的效果，在安裝介質(zhì)的折射率應(yīng)當(dāng)與所使用的浸沒(méi)的索引（浸漬液=1.518，也見(jiàn)步驟5）。目前在我們的投資組合干浸的物鏡。
該結(jié)構(gòu)必須是光學(xué)上可訪問(wèn)的。自發(fā)熒光，折射率的突然和不可預(yù)測(cè)的變化（如含有空氣，髓鞘和脂肪組織）可影響焦斑的形狀和顯微鏡的結(jié)果的性能。如果與結(jié)算解決方案的經(jīng)驗(yàn)是可用的，它可能是值得的測(cè)試。
在STED成像，樣品在592納米或660納米的波長(zhǎng)照射強(qiáng)光。這是該試樣沒(méi)有在這些波長(zhǎng)處吸收光至關(guān)重要。
步驟2:選擇熒光團(tuán)
有一個(gè)廣泛的徠卡STED顯微鏡表現(xiàn)良好的熒光基團(tuán)（如見(jiàn)附錄A）。為了達(dá)到幾個(gè)小時(shí)，在這一個(gè)系統(tǒng)示范正常范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了令人滿意的結(jié)果，最好是留在熒光徠卡提出的保留節(jié)目。如果這是不可能的，熒光團(tuán)應(yīng)選擇，它們具有相似的激發(fā)和發(fā)射光譜的建議染料。這也有利于入手單色染色和，一旦這些被批準(zhǔn)，轉(zhuǎn)移到多色實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)參閱附錄B和C的推薦熒光體組合多色實(shí)驗(yàn)，它不需要額外的光譜分離。對(duì)于受激發(fā)射損耗，以提高工作效率，無(wú)論是熒光的發(fā)射光譜需要顯示的受激發(fā)射損耗波長(zhǎng)顯著發(fā)射（見(jiàn)例之星440SX和俄勒岡綠488在下面的圖）。
為了使染料和類似的排放不同激發(fā)的光譜分離是必需的。為受激發(fā)射損耗與592納米，這是通過(guò)使用大的斯托克斯位移染料（BD V500，STAR440SX，STAR470SX）與位于更遠(yuǎn)的頻譜的左邊吸收光譜，比常規(guī)染料的吸收光譜常常實(shí)現(xiàn)。
它主要是能夠包括額外的染料為更多的顏色。門(mén)控受激發(fā)射損耗技術(shù)使染料與可敬的決議（顯著低于80納米）的受激發(fā)射損耗相同波長(zhǎng)的顯著不太嚴(yán)格的選擇。這最終使得與592線受激發(fā)射損耗（如星440SX，俄勒岡綠488和Alexa Fluor532）三色標(biāo)記成像。門(mén)控受激發(fā)射損耗三色成像三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)染料與660激光受激發(fā)射損耗（如Alexa的488，將Alexa Fluor532和TMR）的實(shí)現(xiàn)。
STED顯微鏡提供了最可靠的超分辨共定位數(shù)據(jù)。受激發(fā)射損耗甜甜圈/行確定的熒光可以被去除，因此該通道可以被視為本質(zhì)上一致。當(dāng)然，人們也可以依次用幾個(gè)STED行工作，以達(dá)到最佳的可能的解決方案對(duì)于給定的熒光團(tuán)，但對(duì)于完美的共定位數(shù)據(jù)，這可能需要修正，因?yàn)樗鼈兪菫槠渌某直媛始夹g(shù)必需為好。
另外其他的熒光標(biāo)記物可被用作counterstainings用共聚焦分辨率。這些染料的發(fā)射，然而，應(yīng)該駐留的受激發(fā)射損耗檢測(cè)的范圍，能夠以其他方式與STED圖像質(zhì)量干擾之外。此外，它很可能是這些染料將吸收強(qiáng)STED消耗光并得到漂白。因此，所有的參照?qǐng)D像應(yīng)受激發(fā)射損耗圖像之前被收購(gòu)。
注意，使用DAPI和Hoechst公司可能對(duì)圖像質(zhì)量（背景）有負(fù)面影響，特別是與592毫微米STED耗盡激光。
步驟3:選擇主要抗體/標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)
為了分析給定樣品中的受激發(fā)射損耗的性能，該試驗(yàn)被最佳地劃分成兩部分。 A部分和B可能并行執(zhí)行，其中A為對(duì)照實(shí)驗(yàn)二
A) 在根據(jù)環(huán)境評(píng)價(jià)的STED性能
熒光染料和抗體是明智的周?chē)h(huán)境（pH值，鹽濃度，氧化還原試劑）。為了從給定的樣品檢查染料的性能，在第一步驟中，一個(gè)完善的初級(jí)抗體，應(yīng)選擇，給出了一個(gè)具體的，明亮的染色。即使沒(méi)有實(shí)際的生物相關(guān)性，此步驟有助于確保將染料按預(yù)期在周?chē)h(huán)境中。
B）與所述感興趣結(jié)構(gòu)工作
在第二步驟中，在技術(shù)上更為苛刻染色可以成像，現(xiàn)在針對(duì)所感興趣的實(shí)際結(jié)構(gòu)。
標(biāo)記密度起著超分辨率重要的作用，但它不能被正確地與常規(guī)的顯微鏡檢查。通常，在染色過(guò)程中，增加抗體濃度已有助于提高樣品質(zhì)量。因此，建議具有較高的抗體濃度（2?5倍）的受激發(fā)射損耗成像合作，以確保最佳標(biāo)記密度。
明智的做法是測(cè)試不同的小學(xué)和中學(xué)染料濃度在步驟A和B染色的質(zhì)量（亮度/背景），應(yīng)檢查并有可能使用之前STED成像傳統(tǒng)的顯微鏡進(jìn)行了優(yōu)化。
步驟4:例如抗體染色
警告 | 有害物質(zhì) |
| 預(yù)防措施來(lái)保護(hù)你，其他人與環(huán)境 |
在抗體染色程序執(zhí)行的每個(gè)動(dòng)作對(duì)樣品的質(zhì)量有顯著影響。每個(gè)步驟將細(xì)胞培養(yǎng)用標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光協(xié)議的方式來(lái)簡(jiǎn)單地說(shuō)明，作為一個(gè)例子中的最優(yōu)化步驟為他/她自己的協(xié)議，以幫助用戶：
試劑
?磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），pH值7.4
? 在PBS中的2％多聚甲醛（PFA）
? 1％ Triton的PBS
? 牛血清白蛋白（BSA）
過(guò)程
所有的步驟都是在室溫下進(jìn)行,評(píng)論是在括號(hào)中。
沖洗3次，用PBS
（細(xì)胞應(yīng)洗滌，培養(yǎng)基由幾次漂洗培養(yǎng)除去。組織應(yīng)解剖并從部件可能妨礙圖像采集洗凈，用建立的實(shí)驗(yàn)室協(xié)議，如果它們是已知的工作。樣品必須輕輕地和快速地處理，這本來(lái)會(huì)導(dǎo)致過(guò)早死亡和分解。）在PBS中進(jìn)行15分鐘固定與2％ PFA
（樣品固定在樣品制備中的關(guān)鍵步驟，因?yàn)樗x了如何很好的結(jié)構(gòu)將被保留。隨著分辨率這個(gè)步驟變得更加重要，應(yīng)小心處理。PFA是一種常見(jiàn)的固色劑，但它并不總是表現(xiàn)最佳之一。這里可能需要一些研究在文獻(xiàn)和優(yōu)化。替代地，溫育5分鐘，用冰冷的（-20℃）100％甲醇中可以使用的甲醇固定不需要額外的通透性的步驟，因此，步驟5和6可以用甲醇固定被忽略，也參見(jiàn)下文）。沖洗3次，用PBS
(刪除更高濃度的固定液為以下步驟)。與PBS洗滌3次進(jìn)行5分鐘
(刪除其余的固定液以下步驟)。在PBS 10分鐘通透與0.1％的Triton
（關(guān)鍵步驟以顯示表位的第一抗體。較低濃度/短的孵育時(shí)間可更好地保持了結(jié)構(gòu)，但妥協(xié)標(biāo)記密度，較高的濃度/較長(zhǎng)的孵育時(shí)間可能使表位更容易獲得的抗體，但也惡化的結(jié)構(gòu)。某些固定劑（如甲醇），不需要額外的通透步驟。）與PBS沖洗3倍
（去除滲透劑。）在PBS中的2％BSA的1小時(shí)
（阻斷可以用不同的試劑來(lái)進(jìn)行，通常由結(jié)合于非特異性結(jié)合伴侶，否則將結(jié)合的抗體與增加的熒光染料的非特異性標(biāo)記的惰性蛋白質(zhì)，也是最好用封端劑而與抗體孵育作為血清有助于保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，較厚的組織，可能需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間。）孵化與第一抗體進(jìn)行1小時(shí)
（用較高的抗體濃度可能是受激發(fā)射損耗試驗(yàn)很有幫助，潛伏期較長(zhǎng)時(shí)間經(jīng)常給出更好的結(jié)果，但要注意可能增加的背景下，在較厚的樣品（如全坐騎）潛伏期可能長(zhǎng)達(dá)幾天，或者潛伏期可以做到在4℃下過(guò)夜）。與PBS洗滌3次進(jìn)行5分鐘
（洗滌步驟是重要的，使用高濃度的抗體，尤其是當(dāng)5分鐘為單位的絕對(duì)最小的洗滌步驟，在這里，否則轉(zhuǎn)移到10或20分鐘的孵育和更多次獲得更好的結(jié)果上漂洗步驟可能加快該過(guò)程。）孵化與二次抗體進(jìn)行1小時(shí)
（您可能需要采用/優(yōu)化抗體濃度為您的應(yīng)用孵化與二次抗體應(yīng)該進(jìn)行類似的一抗孵育二抗一個(gè)良好的起點(diǎn)是1稀釋：100，從商業(yè)來(lái)源的時(shí)候買(mǎi)的，否則，5×比推薦的稀釋更高對(duì)于貝克頓迪金森和V500染色使用生物素化的抗體從杰克遜免疫研究實(shí)驗(yàn)室以1稀釋度：100在這個(gè)步驟中溫育，也可以一蹴而就較厚的組織需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間）。與PBS洗滌3次進(jìn)行5分鐘
(刪除 從樣本的抗體。 更長(zhǎng)、更洗步驟將提高質(zhì)量和特異性的熒光標(biāo)簽。 以前的清洗步驟可能加速這一過(guò)程。)額外的步驟只需要與BD V500染色時(shí):
?孵化與Streptavidin-V500 30分鐘
(額外的步驟當(dāng)BD V500用于熒光標(biāo)記。 稀釋的V500應(yīng)該1:50。 可能需要更長(zhǎng)時(shí)間孵化項(xiàng)目心臟組織。)
?清洗與PBS 3 x 5分鐘
(刪除釋放Streptavidin-V500從樣本。 更長(zhǎng)、更洗步驟將提高質(zhì)量和特異性的熒光標(biāo)簽。 以前的清洗步驟可能加快進(jìn)程。)安裝
(見(jiàn)下面的步驟5)存儲(chǔ)在4°C
最后,染色應(yīng)該清晰和明亮,當(dāng)通過(guò)目鏡觀察時(shí)(如592年發(fā)生的:GFP設(shè)置單一的顏色,或CFP / YFP設(shè)置雙顏色與標(biāo)準(zhǔn)和大斯托克斯位移染料)和產(chǎn)量好信號(hào)噪聲在共聚焦或?qū)捯晥?chǎng)熒光顯微鏡。
第五步:安裝
該安裝介質(zhì)應(yīng)具有的折射率匹配，以使最高穿透深度沒(méi)有令人不快的畸變所要求的目標(biāo)的浸漬。此外，沒(méi)有自發(fā)熒光應(yīng)與592納米或660納米的激光照射時(shí)，可以觀察到，也不應(yīng)含有DAPI或Hoechst公司（為592毫微米STED）。或者，如果DNA /細(xì)胞核染色要求，PicoGreen（Invitrogen）中被發(fā)現(xiàn)與兩個(gè)592納米和660納米STED表現(xiàn)良好。
在某些情況下，安裝的介質(zhì)影響的大的斯托克斯位移染料的熒光量子產(chǎn)率（例如的Vectashield），或熒光蛋白和一些綠色染料（如TDE - 染料在TDE工作請(qǐng)參閱施陶特等人的列表，2007）。因此，我們不與大Stoke's移染料推薦的Vectashield的利用起來(lái)。延長(zhǎng)黃金（Invitrogen公司）也表現(xiàn)良好在我們的手中，并建議由徠卡。
非常良好的結(jié)果也與相當(dāng)簡(jiǎn)單的自制甘油基于安裝獲得如下所述：
甘油
通過(guò)結(jié)合不同數(shù)量的水(PBS)和甘油(甚至只是純甘油)折射率(RI)可以精確調(diào)整在1.33和1.47之間。 此外,它很容易準(zhǔn)備,適合長(zhǎng)樣本存儲(chǔ)在-20°C。Mowiol
6克的甘油(分析純),加入2.4克Mowiol粉(Calbiochem # 475904),6毫升水的桌子,12毫升0.2三羥甲基氨基甲烷緩沖液的pH值8和攪拌大約4小時(shí)的解決方案。 隨后讓解決方案其他額外的2小時(shí)。 孵化Mowiol 10分鐘50°C(水浴)和離心機(jī)的解決方案在5000克15分鐘。 最后,把上層的凍結(jié)存儲(chǔ)介質(zhì)在-20°C。 Mowiol是迄今為止最適合介質(zhì)發(fā)生的圖像,可用于-20°C存儲(chǔ)的樣本。
所有徠卡物鏡與蓋玻片校正修正為1.5 #蓋玻片(優(yōu):0.170±0.01毫米厚,Hecht-Assistent,貓。 1014/2424),數(shù)量應(yīng)該用于安裝和大大提高圖像質(zhì)量而發(fā)生的# 1蓋玻片不僅也為共焦成像。
常見(jiàn)的不變色,例如DABCO(2.5%)或核計(jì)劃組(4%),也可能導(dǎo)致重大改變所使用的染料和有時(shí)photo-physical屬性發(fā)生的。
第六步:實(shí)時(shí)成像
徠卡TCS SP8 STED3X模塊目前僅支持倒置顯微鏡代表和現(xiàn)場(chǎng)成像程序，必須做相應(yīng)的調(diào)整。良好的結(jié)果已經(jīng)報(bào)告了一系列熒光蛋白。
熒光蛋白 | 激發(fā)(nm) | 損耗(nm) |
|---|---|---|
mTurquoise2 | 434 | 592 |
eGFP | 484 | 592 |
EmGFP (Emerald) | 487 | 592 |
mNeonGreen | 506 | 592 |
eYFP | 514 | 592/660 |
Venus | 515 | 592/660 |
mCitrine | 516 | 592/660 |
dsRed | 558 | 660 |
mStrawberry | 574 | 660 |
但是，用于標(biāo)記活體細(xì)胞（如微管蛋白跟蹤綠，俄勒岡綠BABTA）也有機(jī)染料是有說(shuō)服力的。
如果實(shí)時(shí)成像實(shí)驗(yàn)需要的話，最好是直接從徠卡人員以澄清的實(shí)驗(yàn)步驟，并且如果必要的設(shè)備出現(xiàn)在現(xiàn)場(chǎng)。
附錄A:合物進(jìn)行染色的名單
熒光團(tuán) | 激發(fā) (nm) | 消耗 (nm) | 提供者 | Cat. number |
|---|---|---|---|---|
Biotinylated Antibody | – | – | Jackson Immunoresearch | 115-065-003 (老鼠) |
BD Horizon V500** | 458/470 | 592 | Beckton & Dickinson | 561419 (Streptavidin) |
Abberior STAR 440SX** | 458/470 | 592 | Abberior | 2-0002-003-7 (老鼠) |
ATTO 488 | 488 | 592 | Sigma-Aldrich | 62197 (老鼠) |
Abberior STAR 488* | 488 | 592 | Abberior | 2-0002-006-8 (老鼠) |
Alexa Fluor 488* | 488 | 592 | life technologies | A11001 (老鼠) |
Chromeo 488* | 488 | 592 | Active Motif | 15051 (老鼠) |
FITC | 488 | 592 | Sigma-Aldrich | F0257 (老鼠) |
DyLight 488* | 488 | 592 | Thermo Scientific | 35502 (老鼠) |
Chromeo 505** | 488/514 | 592 | Active Motif | 15050 (老鼠) |
Oregon Green 488** | 488/514 | 592 | life technologies | 06380 (老鼠) |
Abberior STAR 470SX** | 470 | 660 | Abberior | 2-0002-004-4 (老鼠) |
Alexa Fluor 514**+ | 514 | 592/660 | life technologies | A31555 (老鼠) |
Alexa Fluor 532**+ | 532 | 592/660 | life technologies | A11002 (老鼠) |
Alexa Fluor 546** | 546 | 660 | life technologies | A11030 (老鼠) |
Cy3** | 550 | 660 | life technologies | A10521 (老鼠) |
Tetramethylrhodamine/TRITC** | 554 | 660 | life technologies | A16071 (老鼠) |
Alexa Fluor 555** | 555 | 660 | life technologies | A21424 (老鼠) |
CF 555* | 550 | 660 | Biotium Inc. | 20031 (老鼠) |
Alexa Fluor 568**+ | 568 | 660 | life technologies | A11004 (老鼠) |
Alexa Fluor 594**+ | 594 | 660 | life technologies | A11032 (老鼠) |
附錄A：報(bào)道與徠卡STED顯微鏡工作的一些結(jié)合物的清單。
* 推薦染料單色實(shí)驗(yàn);
* *推薦染料單、雙和三色實(shí)驗(yàn)。
+ 可能需要先進(jìn)的成像參數(shù)設(shè)置，由于較高的抗中風(fēng)的激勵(lì)，如小針孔，受激發(fā)射損耗低激光功率和高門(mén)啟動(dòng)值。
附錄B:推薦雙顏色染料組合單發(fā)生的激光線*
STED: 592nm ,660nm | |||||
染料1 | 染料2 | ||||
名字 | 激發(fā) | 發(fā)射:例如 | 的名字 | 激發(fā) | 發(fā)射:例如 |
BD Horizon V500 | 485/470 | 475 - 510 | Oregon Green 488/Chromeo 505 | 514/520 | 523 - 580 |
Abberior STAR 440SX | 458/470 | 475 - 515 | Oregon Green 488/Chromeo 505 | 514/520 | 523 - 580 |
Alexa Fluor 532 | 514年 | 520 - 565 | TMR/TRITC/Alexa Fluor 568 | 580 | 590 - 650 |
Chromeo 505 | 505年 | 515 - 565 | TMR/TRITC/Alexa Fluor 568 | 580 | 590 - 650 |
*染料的光譜可能轉(zhuǎn)向，由于環(huán)境條件，結(jié)合型和樣品的年齡。我可能需要最佳光譜分離的激勵(lì)線和檢測(cè)范圍略有調(diào)整。原則上，建議的染料進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有或通道之間只有很小的交叉談判。
附錄C：推薦三色染料組合，單個(gè)和多個(gè)受激發(fā)射損耗的激光線*
STED: 592nm ,660nm | ||||||||
染料1 | 染料2 | 染料3 | ||||||
名字 | 激發(fā) | 發(fā)射 | 名字 | 激發(fā) | 發(fā)射 | 名字 | 激發(fā) | 發(fā)射 |
STAR 440 SX** | 470 | 475 - 505 | Oregon Green 488 | 510 | 515 - 530 | Alexa Fluor 532 | 540 | 550 - 585 |
Oregon Green 488** | 470 | 475 - 525 | Alexa Fluor 532 | 532 | 538 - 550 | TMR/TRITC | 580 | 590 - 650 |
Alexa Fluor 514** | 480 | 490 - 535 | Alexa Fluor 546 | 540 | 545 - 580 | Alexa Fluor 594 | 590 | 600 - 650 |
* 染料的光譜可能轉(zhuǎn)向，由于環(huán)境條件，結(jié)合型和樣品的年齡。我可能需要最佳光譜分離的激勵(lì)線和檢測(cè)范圍略有調(diào)整。原則上，建議的染料進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有或通道之間只有很小的交叉談判。
* *多色圖像可以通過(guò)使用嵌合STED只有激光或兩者STED激光器幀獲取/依次堆疊