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徠卡顯微鏡超分辨率gsdim顯微鏡

2020-09-03 14:25:00

 納米技術(shù) GSDIM (其次是個(gè)別分子返回基態(tài)枯竭顯微鏡) 提供詳細(xì)的圖像的蛋白質(zhì)和其他生物分子在細(xì)胞內(nèi)的空間布局。幫助向更多的研究實(shí)驗(yàn)室和成像中心的用戶提供的GSDIM 技術(shù)市場(chǎng)上第一個(gè)商業(yè)系統(tǒng) （徠卡 SR GSD） 是現(xiàn)在。利用超分辨率 GSDIM顯微鏡，細(xì)胞隔間和地區(qū)，如纖毛或單一的蛋白質(zhì)，與他們互動(dòng)的伙伴可以成像分辨率低于衍射極限，即在兩位數(shù)納米的范圍，使得科學(xué)家們能更多地了解細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的相互作用。時(shí)間，在這方面的知識(shí)可能導(dǎo)致更好的理解細(xì)胞以前無法治愈的疾病的原因。

奧林巴斯顯微鏡

GSDIM 顯微鏡的原理

在傳統(tǒng)的熒光顯微鏡中一種熒光染料的離域的 π 電子從地面狀態(tài) S0 轉(zhuǎn)移到一種興奮狀態(tài) S1。當(dāng)他們回到基態(tài) S0 振蕩，他們發(fā)出的熒光光。GSDIM 技術(shù)，降低了通過切換到黑暗的狀態(tài) （圖 1） （F?lling et al.，2008 年，Bierwagen et al.2010年，種皮 et al.，2010年） 大部分的熒光染料在此振蕩周期中涉及的電子數(shù)目。這減少了可激發(fā)熒光團(tuán)的數(shù)量，直到可以檢測(cè)到單分子。單分子然后自發(fā)地從黑暗狀態(tài)返回一個(gè)易激動(dòng)的地面狀態(tài)并發(fā)出熒光，而其他人都通過切換到黑暗狀態(tài)再次停用。其結(jié)果是，熒光分子點(diǎn)亮或試樣中"作祟"。單個(gè)熒光團(tuán)的確切位置可以通過一種算法確定。所有的熒光團(tuán)的位置信息收集在數(shù)千個(gè)單獨(dú)的圖像，其坐標(biāo)用來計(jì)算超分辨率 GSDIM 圖像。GSDIM 圖像中所示的結(jié)構(gòu)因此起源方式類似的流水賬風(fēng)格的繪畫。

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圖 1： 基于一個(gè)簡(jiǎn)化的雅布倫斯基圖的 GSDIM 方法的示意圖。離域的 π 電子的熒光團(tuán)可以是，例如，在地面狀態(tài) S0，在興奮狀態(tài) S1 （既所謂的國(guó)家） 或三重態(tài)或激進(jìn)黑暗狀態(tài) （這兩個(gè) OFF 狀態(tài)）。當(dāng)發(fā)出熒光光時(shí)，電子和流通，地面興奮的狀態(tài)。這些方面與國(guó)家不同，在關(guān)閉狀態(tài)下的熒光團(tuán)都不能夠發(fā)出的光。這些 OFF 狀態(tài)通常的使用壽命長(zhǎng)，但他們是很難達(dá)到，由于國(guó)米系統(tǒng)過境所需。通過設(shè)置右環(huán)境條件嵌入介質(zhì)中和通過的標(biāo)準(zhǔn)熒光免疫熒光為聰明的選擇，有可能到可逆開關(guān)熒光團(tuán)通過令人興奮的他們與極端的光強(qiáng)度。當(dāng)足夠的分子在關(guān)閉狀態(tài)下，有可能來檢測(cè)樣品中的個(gè)別分子。

 

 

 

 

 

首要的纖毛，非常規(guī)的細(xì)胞器為上皮細(xì)胞極性的組織
初級(jí)纖毛是在根尖表面的極化的上皮細(xì)胞，人體的細(xì)胞基于 microtubuli 的結(jié)構(gòu)。這種形式的 monocilia 發(fā)現(xiàn)，例如，對(duì)種涂層的腎、 膽、 胰管上皮細(xì)胞。在這里他們發(fā)揮關(guān)鍵作用作為機(jī)械傳感器 — — 例如，他們決定組成流體或他們的流動(dòng)率（Fliegauf 等，2007年）。同時(shí)，他們也參與維持細(xì)胞極性，如有與梅丁達(dá)秘 (MDCK)犬腎細(xì)胞 （Bacallao 等，1989年） 圖所示。初級(jí)纖毛形成在間期細(xì)胞周期從等離子膜相關(guān)依據(jù)約 250 毫微米寬叫做基底體，即軸絲形成這種結(jié)構(gòu) （Singla 等人，2006 年） 的基礎(chǔ)上。基底身體的基本框架包括九個(gè)微管二聚體 (9 + 0)。各中心都設(shè)在這里，被視為基體的必要組成部分。這些蛋白質(zhì)屬于鈣調(diào)素的家庭和有，他們是能夠綁定Ca2 + EF 手主題 （索爾茲伯里，2007年）。Ca2 + 綁定所引起的構(gòu)象變化調(diào)節(jié)與其他蛋白質(zhì)如微管蛋白或半乳糖凝集素 3 中金的相互作用。有四種不同類型的金在小鼠和人的有機(jī)體。金-2 和-3 無所不在表示，并積累在中心粒和 pericentriolar 地區(qū)或在基底身體的單元格。金-1，另一方面，只發(fā)現(xiàn)胚芽細(xì)胞和視網(wǎng)膜，雖然金 4 只發(fā)現(xiàn)完全分化細(xì)胞 （索爾茲伯里，2007年）。
在 ciliogenesis 或纖毛的功能障礙是各種疾病，如視網(wǎng)膜變性、 多囊腎、 腦積水或BBS （Bardet-Biedl 綜合征） 的原因。

 

蛋白質(zhì)組分的基體在超分辨成像
徠卡SR GSD（徠卡顯微系統(tǒng)，韋茨拉爾）是一個(gè)新的多用途的顯微鏡，不僅可用于超分辨率gsdim成像到20納米的分辨率，同時(shí)也為TIRF顯微鏡（全內(nèi)反射熒光）和高速寬視野的活細(xì)胞成像。這給了新的和非常詳細(xì)的見解的根尖膜和蛋白質(zhì)組成的結(jié)構(gòu)。雙染色Centrin-2與微管蛋白用免疫組織化學(xué)方法和成像技術(shù)的gsdim（圖2A）。的微管網(wǎng)絡(luò)下的頂膜可以清楚地可視化。其他可見的特點(diǎn)是半圓形的中央結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的每一次的細(xì)胞。設(shè)置在基體中，這些結(jié)構(gòu)上還沾著Centrin-2。我們可以看到一個(gè)類似Centrin-2分布格局在此之前一樣。圖2b顯示了一個(gè)雙染結(jié)合伙伴Centrin-2 Galectin-3（科赫等人。，2010）。然而，傳統(tǒng)的圖像超分辨率圖像提供了比gsdim更彌漫性的蛋白質(zhì)分配觀。
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圖2：超分辨率gsdim顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡比較。A：gsdim顯微鏡（徠卡SR GSD），MDCK細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片，固定和染色anti-centrin-2 / A488和反α微管蛋白/ alexa647。在基體區(qū)微管蛋白和Centrin-2標(biāo)簽的半圓形結(jié)構(gòu)（箭頭）。規(guī)模：1μM。B：激光共聚焦顯微鏡（徠卡TCS SP2）掃描的頂端區(qū)域的MDCK細(xì)胞的免疫組化染色的anti-centrin-2 / A488和抗-galectin一3 / alexa546。核酸的細(xì)胞用Hoechst 33342染色。X / Y圖像（上）再次顯示了新月形的結(jié)構(gòu)，也包含Centrin-2 Centrin-2的具有約束力的合作伙伴，Galectin-3（箭頭）。X / Z圖像清楚地顯示這些結(jié)構(gòu)位于頂部以上的細(xì)胞核。規(guī)模：1μM.

 

Outlook
GSDIM 技術(shù)產(chǎn)生了下面的衍射極限的細(xì)胞結(jié)構(gòu)光顯微成像技術(shù)的進(jìn)一步突破。樣品制備方法，相同的免疫組織化學(xué)方法可用于已建立在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中衍射受限視場(chǎng)和共聚焦顯微鏡。政府物料供應(yīng)處的顯微鏡可以顯示已經(jīng)看不見了到現(xiàn)在的結(jié)構(gòu)。這可以被提供了更深的洞察力基本過程在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和其合作伙伴的互動(dòng)，高度詳細(xì)成像技術(shù)。在將來，這種技術(shù)將用于獲取新信息的細(xì)胞的原因以前無法醫(yī)治的疾病。