徠卡顯微鏡從小肽的吸收建立和鑒定派生的瓣胃上皮細(xì)胞模型
介紹
反芻動(dòng)物的forestomach歷來是上皮運(yùn)輸研究的建設(shè)性模型，該forestomach，特別是瓣胃（圣經(jīng)），它在營養(yǎng)物從攝取的吸收中起重要作用，例如水，揮發(fā)性脂肪酸，礦物質(zhì)，電解質(zhì)，氨基酸（AA）的和小肽。 有趣的是，相比于瘤胃，瓣胃具有更強(qiáng)的吸收能力小肽。
肽在動(dòng)物營養(yǎng)的吸收和利用進(jìn)行了詳細(xì)審查別處。 肽包含在forestomach的可溶性非氨氮一個(gè)顯著部分和總氨基酸在反芻動(dòng)物的門戶排水內(nèi)臟。 此外，肽可通過乳腺對(duì)乳蛋白的合成被利用和由許多其他組織中的營養(yǎng)和功能活性 。 一些研究已經(jīng)表明，AA的肽的形式的傳輸比AA中的每單位時(shí)間的游離形式更有效。 此外，據(jù)報(bào)道，一個(gè)大數(shù)量的二和三肽和各種模擬肽的藥物是通過寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（PEPT1，SLC15家族）中腸細(xì)胞的頂膜吸收進(jìn)入胃腸道的上皮細(xì)胞。
然而，在小肽在反芻動(dòng)物胃腸道中的吸收許多以前的研究已經(jīng)在動(dòng)物，組織模型或在細(xì)胞系中進(jìn)行的。 然而，大多數(shù)這些細(xì)胞系已經(jīng)失去了器官特異性功能，由于其分化狀態(tài)。 此外，這些研究大多是短期的。 因此，建立基層上皮細(xì)胞反芻動(dòng)物的forestomach孤立的一個(gè)長(zhǎng)期的文化可能為它們的功能研究的一個(gè)更好的模型。 來自各種動(dòng)物的瘤胃得到上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)之前已經(jīng)描述，如綿羊、小母牛和母羊，雖然還沒有研究報(bào)告長(zhǎng)期培養(yǎng)和從奶牛和在這些細(xì)胞中的肽吸收的作用得到瓣胃上皮細(xì)胞（嗅鞘細(xì)胞）的表征。 瓣胃，這是復(fù)層鱗狀組織，由四個(gè)上皮階層，如瘤胃：角質(zhì)層，顆粒層，棘層和基底層。 然而，這是難以分離這些上皮細(xì)胞。 本研究成功地使用特定的胰蛋白酶的濃度和消化時(shí)間通過串行消化法分離這些細(xì)胞。 本研究的目的是：（1）建立和表征牛OEC文化和（2）由forestomach上皮細(xì)胞在體外用嗅鞘細(xì)胞的牛，研究小肽吸收的功能。
材料和方法
操守準(zhǔn)則
這項(xiàng)研究是根據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利（科技部中國科技，2006年）的國家指導(dǎo)方針和批準(zhǔn)的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)在浙江大學(xué)進(jìn)行。 在瓣胃組織是從阜陽屠宰場(chǎng)，杭州，中國獲得和我們獲準(zhǔn)使用這些動(dòng)物部分從這個(gè)屠宰場(chǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)和存儲(chǔ)介質(zhì)
在細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基由Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基（DMEM，Gibco公司，美國），補(bǔ)充有10％（V / V）胎牛血清（FBS）（Gibco公司，美國），5μg/ ml的胰島素，10高葡萄糖制劑納克/毫升的表皮生長(zhǎng)因子（EGF，Sigma公司，美國），100 U / ml青霉素，100微克/毫升鏈霉素，50微克/毫升慶大霉素和2.5微克/毫升兩性霉素B的新鮮制備的細(xì)胞存儲(chǔ)培養(yǎng)基由70％（體積/體積）的DMEM，20％（體積/體積）FBS和10％（體積/體積）二甲基亞砜（Sigma公司，美國）。
分離培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞和
牛瓣胃組織被新生中國荷斯坦?fàn)倥＋@得它們被宰殺后，立即，然后運(yùn)到在冰冷的DMEM實(shí)驗(yàn)室。串行胰蛋白酶消化進(jìn)行，以嗅鞘細(xì)胞分離如前所述。 簡(jiǎn)而言之，將組織洗滌數(shù)次，用冰冷的D-Hank氏（平衡鹽溶液）含有500單位/毫升青霉素，500微克/毫升鏈霉素，100微克/毫升慶大霉素和5微克/毫升兩性霉素B，直到溶液是干凈任何污染物。 接下來，瓣胃上皮薄層是用手術(shù)刀為約1厘米2片切碎。 碎薄片（約20g，濕重）消化在一個(gè)250ml的錐形含有100ml 2.5％胰蛋白酶（Amresco公司，美國）在D-Hank氏在搖動(dòng)溫?zé)峥諝?小時(shí)，溶液在37℃下的燒瓶浴。 接著，將消化溶液棄去，用新鮮溶液替換2或3次，以除去角質(zhì)層上皮細(xì)胞。 當(dāng)一團(tuán)細(xì)胞具有均一的形態(tài)出現(xiàn)，角化細(xì)胞是不占優(yōu)勢(shì)，在消化溶液收獲并用新鮮的溶液中，約每20至30分鐘，這取決于消化狀態(tài)所取代。 胰蛋白酶是細(xì)胞收獲后終止，加入冰冷的D-Hank氏含有10％FBS到消化溶液（以1:1的比例，體積/體積）。 過濾與4層的1毫米的尼龍網(wǎng)孔后，將收獲的溶液離心分離，在300×g離心 5分鐘，在4℃下，以從顆粒除去任何殘留的胰蛋白酶。 接著，將組織進(jìn)一步消化7-8個(gè)周期。 使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞產(chǎn)量進(jìn)行了評(píng)估和細(xì)胞存活率分別使用臺(tái)盼藍(lán)染色，估計(jì)。將細(xì)胞再懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，然后接種5×10 4個(gè)細(xì)胞/ ml在塑料培養(yǎng)皿（康寧，美國）涂布有I型膠原（Gibco）中的密度。 培養(yǎng)皿在37℃和5％CO 2的加濕氣氛和生長(zhǎng)培養(yǎng)基根據(jù)生長(zhǎng)條件改為每2或3天。
以純化的上皮細(xì)胞，融合細(xì)胞分別為第一消化用10分鐘，0.15％的胰蛋白酶溶液。 當(dāng)分離的成纖維細(xì)胞，并沒有變化，嗅鞘細(xì)胞進(jìn)行觀察，將細(xì)胞用D-Hank氏洗滌。 接著，將剩余的細(xì)胞用0.1％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化5-10分鐘，并接種到新的培養(yǎng)皿中（1:2）。 對(duì)冷凍保存，將細(xì)胞以1×10 6個(gè)細(xì)胞/ ml時(shí)，分配到冷凍管的密度重新懸浮在存儲(chǔ)介質(zhì)中，并儲(chǔ)存在液氮中。
用于蘇木精和伊紅染色，將組織固定在4％甲醛溶液中。 24小時(shí)后，將組織包埋在石蠟中，切成5μm的切片并用H＆E對(duì)用標(biāo)準(zhǔn)方法組織學(xué)檢查。
嗅鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)特性
嗅鞘細(xì)胞的體外生長(zhǎng)方式是由細(xì)胞的倍增時(shí)間確定。 采用WST-8（博士德，中國）檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 簡(jiǎn)言之，嗅鞘細(xì)胞在96孔板（康寧，美國）一式四份接種5×10 3每孔的細(xì)胞。 在特定時(shí)間點(diǎn)，將10μl的WST-8溶液加入到每個(gè)孔中。 接著，將細(xì)胞溫育于37℃下反應(yīng)1小時(shí)，將吸光度在450nm的波長(zhǎng)用酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司，美國）測(cè)定。 活細(xì)胞的數(shù)目是成比例的吸光度。 用相襯顯微鏡（Nikon ECLIPSE 50i的，東京，日本），將細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)進(jìn)行了評(píng)估。
電子顯微鏡對(duì)嗅鞘細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)
嗅鞘細(xì)胞用PBS洗滌兩次，然后固定，用2.5％戊二醛在4℃下過夜。 將細(xì)胞用PBS漂洗兩次，后綴，用1％************為2小時(shí)。 在串行乙醇稀釋脫水的細(xì)胞后，將細(xì)胞從它們的塑料支撐報(bào)廢和嵌入的Spurr樹脂。 超薄切片中依次沾上醋酸雙氧鈾和堿性檸檬酸鉛，每次15分鐘，并用透射電子顯微鏡（TEM，JEM-1230，JEOL）觀察。
首先對(duì)掃描電子顯微鏡（SEM）制成OEC蓋玻片。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序用于TEM固定和脫水后，將試樣涂覆有金 - 鈀和使用SEM（飛利浦，XL30，荷蘭）的觀察。
免疫細(xì)胞化學(xué)染色
細(xì)胞角蛋白染色，將細(xì)胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿（巢，中國），并洗滌3次，用D-Hank氏，用于在-20℃下10分鐘，用甲醇固定和丙酮（體積/體積），并透化，用0.25 ％PBS-的Triton 10分鐘。 然后將細(xì)胞在PBS中含5％正常山羊血清阻斷非特異性蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行孵育初級(jí)兔抗細(xì)胞角蛋白18抗體（稀釋至1:50，Abcam公司，HK）和兔抗PEPT1抗體（稀釋1:100，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，中國）一夜之間在4°C。 隨后，將細(xì)胞溫育在次級(jí)FITC-偶聯(lián)的山羊抗兔IgG抗體（稀釋度1:100，杰克遜免疫研究實(shí)驗(yàn)室公司，美國），用DAPI（Sigma公司，美國）。 將細(xì)胞在室溫下在黑暗中溫育1小時(shí)，隨后漂洗3次，用PBS進(jìn)行5分鐘，并用激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，TCS SP5，德國）顯影。
PEPT1 mRNA的嗅鞘細(xì)胞的測(cè)定
從牛瓣胃組織總RNA和嗅鞘細(xì)胞用冰冷的TRIzol（Invitrogen公司，美國）隔離。 RNA的完整性和純度通過使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)（熱，USA）評(píng)估樣品用1％瓊脂糖凝膠電泳，并根據(jù)在λ260和λ280（> 1.8）的外徑比被確認(rèn)。 合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本滋賀縣）第一鏈cDNA。 （;產(chǎn)品長(zhǎng)度正向：5'-TGGCTGGGGAAGTTCAAGAC-3'5'-TCCTGGCCCTCTTCAAA-3，反向'：239堿基對(duì)）用反轉(zhuǎn)錄PCR使用以下特異性引物檢測(cè)PEPT1（NM_001099378）的表達(dá)，以及甘油醛-6 -磷酸脫氫酶基因（GAPDH，AJ000039）擔(dān)任內(nèi)部控制（引物：正向5'-TTGTGATGGGCGTGAACC-3'，反向5'-CCCTCCACGATGCCAAA-3';產(chǎn)品長(zhǎng)度：198個(gè)基點(diǎn)）。 所用的PCR條件進(jìn)行以下操作：在95℃下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的5秒，34號(hào)，60℃和60秒，72℃下用30秒，在95℃初始變性和5分鐘的最后延伸72°C。 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠，并用市售的測(cè)序公司（BGI，中國）測(cè)序。 的DNA序列進(jìn)行比對(duì)來自國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中的已知PETP1序列。
攝取甘氨酸-SAR成嗅鞘細(xì)胞
glycylsarcosine的攝?。℅LY-SAR，模型二肽）的嗅鞘細(xì)胞是如前所述研究 。 Hank氏平衡鹽溶液（HBSS：145 mM氯化鈉，3 mM的氯化鉀，1mM的氯化鈣 ，0.5毫摩爾MgCl 2）含有5mM D-葡萄糖和5mM HEPES（pH6.5）中被用作吸收和沖洗介質(zhì)。 嗅鞘細(xì)胞鋪板在1×105個(gè)細(xì)胞/ cm 2在24孔板中的密度。 匯合（約3天）后，將細(xì)胞保持7天，以分化。 接著，用電子顯微鏡，這表明細(xì)胞已分化形成的微絨毛，橋粒和緊密連接下觀察細(xì)胞。 在同一天，OEC單層細(xì)胞漂洗兩次，預(yù)培養(yǎng)用HBSS 30分鐘，在37℃下 攝取加入1 ml的培養(yǎng)液在不同pH下（5.0，5.5，6.5，7.5），并為特定時(shí)間段（2，5，10，15，30分鐘）啟動(dòng)。 研究了濃度的甘氨酸基-Sar攝取依賴，細(xì)胞與不同甘氨酸-SAR的濃度（0.5，1.0，1.5，2.5，5.0毫摩爾），在37℃或4℃。 用于抑制研究中，將細(xì)胞在37℃孵育不同的蛋氨酸 - 甘氨酸（甲硫氨酸 - 甘氨酸）的濃度（0，0.5，2.5，5.0毫摩爾）在一式四份 所有孵育均在37℃進(jìn)行15分鐘，在用2.5mM的甘氨酸基-Sar pH為6.5，除非另有說明。 在孵育結(jié)束時(shí)，甘氨酸基-Sar溶液吸出，并將細(xì)胞快速洗滌四次，用冰冷的漂洗培養(yǎng)基（pH6.5）中。
以確定甘氨酸基-Sar的攝取量，裂解細(xì)胞用0.3毫升1％的Triton X-100溶液。 細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的一部分離心12000×g的10分鐘，并使用利用高效液相色譜法（HPLC，安捷倫，1100，美國），如下所述進(jìn)行量化甘氨酸基-Sar。 裂解液的另一部分被用于使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒（凱基生物科技，南京，中國）蛋白質(zhì)測(cè)定。 GLY-SAR的攝取換算為nmol /毫克protein/15分鐘。
HPLC條件：流動(dòng)相：緩沖液A（0.1％三氟乙酸的水）和B（0.1％三氟乙酸的乙腈溶液）的混合物。 梯度洗脫，運(yùn)行在10分鐘內(nèi)，從10％緩沖液B為原料，以50％緩沖液B，以1.0毫升/分鐘的流速。 采用Kromasil 100-5C 18（4.6毫米×250毫米;阿克蘇諾貝爾公司，瑞典）用作分析柱。 將樣品的等分試樣（10微升）注入HPLC系統(tǒng)和甘氨酸基-Sar是在220nm處進(jìn)行檢測(cè)。
統(tǒng)計(jì)分析
經(jīng)方差分析和鄧肯的使用SAS軟件（SAS研究所，2000年）復(fù)極差測(cè)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 該數(shù)據(jù)被表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。 的標(biāo)準(zhǔn)意義成立為P <0.05。
結(jié)果
嗅鞘細(xì)胞的建立及生長(zhǎng)特性
消化，用2.5％胰蛋白酶為1?1.5小時(shí)后，角質(zhì)層除去。 約5小時(shí)后，大部分的上皮細(xì)胞被成功地從組織中分離出不含細(xì)胞的子層的污染（ 圖1 ）。 使用染料排除可行性的研究表明，90％的分離的細(xì)胞是存活的（ 圖2-A ）。 分離的細(xì)胞粘附于塑料基體的壁培養(yǎng)（12小時(shí)后， 圖2-B ）。隨后，嗅鞘細(xì)胞開始增殖并經(jīng)過2?7天在培養(yǎng)物（圖2-C形成簇之前到達(dá)匯合）（ 圖2-D ）。 成纖維細(xì)胞混合嗅鞘細(xì)胞的原代培養(yǎng)。 消化用0.15％胰蛋白酶后，首先從燒瓶壁，其余的嗅鞘細(xì)胞分離的成纖維細(xì)胞用0.1％胰蛋白酶-0.02％EDTA溶液，然后被釋放。 純化后，嗅鞘細(xì)胞顯示均相“鵝卵石”上皮細(xì)胞樣形態(tài)與幾個(gè)可見的成纖維細(xì)胞。 此外，有2-4個(gè)核仁中的每個(gè)OEC和純化的細(xì)胞顯示出與在該塑料基體緊密連接的模式（一個(gè)清晰的邊界圖2-E ）。 冷凍和解凍后，90％的嗅鞘細(xì)胞是存活的，并表現(xiàn)出正常上皮形態(tài)。 細(xì)胞單層形成后數(shù)天，cuticularized細(xì)胞出現(xiàn)上面的嗅鞘細(xì)胞（ 圖3-A，B ）和單層證明圓頂形結(jié)構(gòu)（ 圖3-C，D ）。
圖1，蘇木精和曙紅（H＆E）染色的瓣胃墻。
答：胰蛋白酶處理前瓣胃內(nèi)壁具有完整上皮層（箭頭）。 箭頭表示上皮地層。 B：在瓣胃墻面無胰蛋白酶處理后上皮階層。 條形代表100微米。
DOI：10.1371/journal.pone.0088993.g001
圖 2，孤立的瓣胃上皮細(xì)胞 形態(tài)在不同生長(zhǎng)時(shí)期。
答：酶消化后，新生犢牛獲得的（×200）上皮細(xì)胞懸液; B：大多數(shù)堅(jiān)持以塑料基質(zhì)與少量成纖維細(xì)胞的壁培養(yǎng)12小時(shí)后（×200）的瓣胃上皮細(xì)胞; C：2 d后培養(yǎng)（×100）細(xì)胞簇觀察; D：在文化形成融合單層后大約一個(gè)星期（×100）; E：凈化文化顯示的鵝卵石樣形態(tài)（×100）; F：梭形，成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（×100）的融合單層; 成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，用箭頭表示。DOI：10.1371/journal.pone.0088993.g002
圖3，嗅鞘細(xì)胞的融合單層的 開發(fā)形態(tài)。
答：Cuticularized細(xì)胞融合后的階段嗅鞘細(xì)胞起源（×200）; B：相襯的重點(diǎn)放在提高cuticularized細(xì)胞（×200）的頂部設(shè)置圖像; 箭頭表示典型cuticularized細(xì)胞。C（×100）和D（×200）：細(xì)胞的募集層上方的塑料基體的圓頂結(jié)構(gòu)（箭頭）。
DOI：10.1371/journal.pone.0088993.g003嗅鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)圖案繪制于圖4中 。的2天的初始延遲后，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（2-5天），然后將細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，達(dá)到平臺(tái)期。 嗅鞘細(xì)胞表現(xiàn)出了穩(wěn)定的成長(zhǎng)能力，人口倍增62 h的時(shí)間（ 圖4）。
嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)中圖4。 生長(zhǎng)曲線。
對(duì)數(shù)期開始的滯后相位的2天之后，用一個(gè)尖銳的傾斜和進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期的第5天的細(xì)胞。N = 4。
DOI：10.1371/journal.pone.0088993.g004嗅鞘細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)
形成后嗅鞘細(xì)胞的單層在7天中文化，用透射電子顯微鏡和掃描電鏡（觀察嗅鞘細(xì)胞單分子膜的超微結(jié)構(gòu)圖5 ）。 極化單層觀察根尖的微絨毛和對(duì)塑料基材一個(gè)基底層。 微絨毛是管腔腸上皮細(xì)胞的特征。 此外，橋粒，張力原纖維，緊密連接和基底膜內(nèi)陷的融合細(xì)胞單層的相鄰小區(qū)之間可以觀察到。 這種類型的OEC單層在下面描述的傳輸研究中使用。
圖5，透射電子顯微鏡（TEM，A和B）和嗅鞘細(xì)胞單層的掃描電子顯微鏡（SEM，C和D）。
答：偏光單層成立，根尖微絨毛（MV）和在塑料基質(zhì)上一基底層; B：通過橋粒（德），緊密連接（TJ）和基底膜內(nèi)陷相鄰細(xì)胞之間的連接（*）也清晰可見。 張力原纖維（T）還觀察到在嗅鞘細(xì)胞。 C和D：SEM觀察揭示了OEC單層的表面上大量的微絨毛樣結(jié)構(gòu)。
DOI：10.1371/journal.pone.0088993.g005細(xì)胞骨架18和PEPT1的表達(dá)
嗅鞘細(xì)胞進(jìn)行染色以檢查細(xì)胞骨架18，中間絲蛋白和上皮細(xì)胞的標(biāo)記物的表達(dá)。 該細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的免疫陽性染色細(xì)胞骨架18（ 圖6 -A）。 PEPT1抗原表達(dá)檢測(cè)免疫細(xì)胞化學(xué)在細(xì)胞質(zhì)和嗅鞘細(xì)胞的細(xì)胞核（ 圖6 -B）。 只用第二抗體的陰性對(duì)照沒有發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞特異性染色（圖6 -C）。
圖6。嗅鞘細(xì)胞的 免疫熒光染色。
嗅鞘細(xì)胞的染色細(xì)胞角蛋白18（A），PEPT1使用二次抗體只（C）（B）和陰性對(duì)照熒光圖像。 細(xì)胞核用DAPI染色。
DOI：10.1371/journal.pone.0088993.g006PEPT1 mRNA的表達(dá)在兩種上皮組織和上皮細(xì)胞（ 圖7 ）。 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的測(cè)序顯示100％匹配，以在GenBank中，其還揭示了分離的細(xì)胞的上皮起源和建議，這些細(xì)胞可以用于研究PEPT1的傳輸性質(zhì)已知的牛線粒體DNA序列。
圖7， 在逆向瓣胃上皮組織和嗅鞘細(xì)胞PEPT1基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)。
道L：100 bp的DNA梯狀條帶; 泳道1：瓣胃上皮組織; 泳道2：嗅鞘細(xì)胞; 泳道3和4：裝載組織的持家基因甘油醛-3 - 磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達(dá)控制（3）和瓣胃上皮細(xì)胞中（4）。
DOI：10.1371/journal.pone.0088993.g007pH值和時(shí)間對(duì)GLY-SAR吸收由嗅鞘細(xì)胞的影響
分離的嗅鞘細(xì)胞表現(xiàn)出的甘氨酸基-Sar二肽一個(gè)顯著攝?。?nbsp;圖8 ）和攝取受細(xì)胞外pH值。 攝取也顯著更高，在pH 5.5和6.5相比，在pH 5.0和7.5（P <0.05， 圖8-A ），這表明在運(yùn)輸過程是pH依賴性。 因此，6.5的細(xì)胞外pH值被用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。 培養(yǎng)GLY-SAR的攝取的最佳時(shí)間也是在嗅鞘細(xì)胞（確定圖8-B ）。 GLY-SAR通過嗅鞘細(xì)胞的攝取增加，培養(yǎng)時(shí)間增加，達(dá)到了5至15分鐘之間的高原。 因此，在隨后的所有實(shí)驗(yàn)中，孵育時(shí)間為吸收量為15分鐘，以確保轉(zhuǎn)運(yùn)飽和。
圖8 pH值和時(shí)間對(duì)GLY-SAR攝取嗅鞘細(xì)胞的影響。
答：吸收GLY-SAR在不同pH為15分鐘。 B：甘氨酸基-Sar的在不同時(shí)間點(diǎn)（分鐘），在pH 6.5的攝取。 N = 4。重視與不同的字母（A，B）表示顯著差異（P <0.05）。
DOI：10.1371/journal.pone.0088993.g008底物濃度，溫度和GLY-SAR吸收競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑通過嗅鞘細(xì)胞的影響
還審議了嗅鞘細(xì)胞在溫度和GLY-SAR濃度的GLY-SAR的吸收的作用。 GLY-SAR的攝取量顯著高于37℃相比，4°C（P <0.05）。 此外，吸收在4℃下呈正比，甘氨酸-SAR的濃度和線性增加未經(jīng)高原（ 圖9-A ）。 溫度對(duì)吸收的影響是通過PEPT1而不是被動(dòng)的路由。 此外，通過PEPT1活性攝取估計(jì)在4℃下的總攝取，在37℃和被動(dòng)的攝取之間的差。 即使在低底物濃度下（<2.5毫米）的介質(zhì)中，吸收在37℃，明顯高于比較至4℃，表明轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)的過程提供更多的吸收的低濃度。 此外，轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)的攝取飽和，2.5毫米GLY-SAR在介質(zhì)中。 當(dāng)GLY-SAR的濃度大于2.5毫米，吸收在37℃相似，在4°C。 此外，2.5mM的甘氨酸基-Sar用于隨后的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，其中的Met-甘氨酸抑制甘氨酸基-Sar的攝取（ 圖9-B ）。 總之，這些結(jié)果表明，同一載體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)既GLY-SAR和Met-甘氨酸。
討論
嗅鞘細(xì)胞的建立與表征
早在新生兒年齡的增長(zhǎng)，反芻瓣胃的上皮細(xì)胞顯示具有完整功能的完整形態(tài)結(jié)構(gòu)。 在這項(xiàng)研究中，我們成功開發(fā)根據(jù)前述方法用于隔離瘤胃上皮細(xì)胞的方法，從初生犢牛隔離嗅鞘細(xì)胞。 形態(tài)學(xué)檢查和PEPT1 mRNA和未接受抗蠕變飲食初生牛犢的瓣胃上皮蛋白表達(dá)證實(shí)，初生犢牛在結(jié)構(gòu)和功能上配備吸收小肽與成人相似。 我們也試圖從成年奶牛隔離嗅鞘細(xì)胞，但遺憾的是都沒有成功，因?yàn)樵摷?xì)胞高度分化，難以純化，增殖和傳代培養(yǎng)。 因?yàn)樾⊥刃崆始?xì)胞的快速自我更新率，細(xì)胞有較高的增殖率較成人嗅鞘細(xì)胞。 此外，它是很容易獲得的新生小牛清潔組織，因?yàn)樗鼈兊奈改c道不沾染飼料和微生物。
角質(zhì)層，它主要包括死細(xì)胞，作為一個(gè)屏障，以營養(yǎng)吸收 ，必須先刪除隔離的謊言下的上皮細(xì)胞。 以前的研究已經(jīng)表明，主瘤胃上皮細(xì)胞可從用含有不同濃度的胰蛋白酶的解離解瘤胃中分離。 在我們的研究中，酶消化的五個(gè)不同的協(xié)議進(jìn)行了檢查（0.25，0.625，1.25，2.5，5％胰蛋白酶），以優(yōu)化OEC隔離。 我們發(fā)現(xiàn)，2.5％胰蛋白酶是最有效的隔離，可行性和嗅鞘細(xì)胞在體外 （數(shù)據(jù)未示出）的粘附性。 它也難以分離，由于細(xì)胞響應(yīng)于胰蛋白酶的敏感性的細(xì)胞; 例如，高濃度的胰蛋白酶是有害的細(xì)胞和低濃度不能充分有效地分離細(xì)胞。 此外，所需要的瓣胃薄層被切成1厘米2枚而不是搗碎，以避免肌肉或其他細(xì)胞的污染從更深的地層相關(guān)的上皮。 我們孤立的嗅鞘細(xì)胞的上皮起源的地層使用來自其中的細(xì)胞中分離的瓣胃的H＆E染色證實(shí)。
在這項(xiàng)研究中，成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞根據(jù)它們的不同的敏感性，胰蛋白酶進(jìn)行分離，如先前報(bào)道。 以前，各種方法被用于抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng); 然而，這是不可能用這些方法完全消除這些細(xì)胞。 經(jīng)過一系列的純化步驟中，我們能夠消除大部分污染的非上皮細(xì)胞（主要是成纖維細(xì)胞）的; 然而，一個(gè)小數(shù)目的成纖維細(xì)胞（細(xì)胞培養(yǎng)物不足10％）仍然存在與嗅鞘細(xì)胞。 以前的研究表明，非上皮細(xì)胞在培養(yǎng)物中的存在可能對(duì)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活的有益效果 。
在這項(xiàng)研究中，我們孤立的嗅鞘細(xì)胞表現(xiàn)出典型的鵝卵石形態(tài)與微絨毛，這也觀察了其他隔離牛腸上皮細(xì)胞系的頂面和原代細(xì)胞。 此外，我們的細(xì)胞也確定了瓣胃上皮作為用電子顯微鏡進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間連接（橋粒和緊密連接）和張力原纖維，這也被在初級(jí)上皮細(xì)胞中觀察到從牛瘤胃的存在和結(jié)腸上皮。 此外，該細(xì)胞具有不斷增殖，形成融合單層，并表達(dá)PEPT1和細(xì)胞角蛋白18的能力，這些特性表明這些細(xì)胞的上皮性質(zhì)。 此外，嗅鞘細(xì)胞在塑料基質(zhì)上的生長(zhǎng)表明一個(gè)群體倍增62 h的時(shí)間和呈現(xiàn)S形生長(zhǎng)曲線（ 圖4 ），即正常的非轉(zhuǎn)化的表型特征。 因此，這是更好接種細(xì)胞時(shí)，融合的單層一直合式后使用這些細(xì)胞進(jìn)行研究，5天。
在嗅鞘細(xì)胞原代培養(yǎng)物，cuticularized細(xì)胞中出現(xiàn)了單層外面大部分區(qū)域，這表明我們的分離的嗅鞘細(xì)胞進(jìn)行分化和成熟的體外類似于體內(nèi)的上皮。 此外，嗅鞘細(xì)胞表現(xiàn)出拱頂狀結(jié)構(gòu)在融合后的階段，這就出現(xiàn)零星地，當(dāng)細(xì)胞在塑料基質(zhì)上涂有膠原蛋白的生長(zhǎng)。 這種結(jié)構(gòu)已報(bào)道發(fā)展，由于流體的上皮細(xì)胞層的下部積累。 自發(fā)穹頂結(jié)構(gòu)的嗅鞘細(xì)胞的形成表明，這些細(xì)胞發(fā)生分化和分泌基底膜成分相似的乳腺上皮細(xì)胞中報(bào)告之前的研究。
通過使用OEC模型研究小肽的吸收
PEPT1是一個(gè)H +的偶聯(lián)肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。 我們的研究顯示，嗅鞘細(xì)胞表達(dá)PEPT1的mRNA，并采取了GLY-SAR中的pH值依賴性為6.5的最佳pH值。 這些觀察結(jié)果表明，PEPT1可能參與在嗅鞘細(xì)胞的小肽的吸收，而這種吸收是有效的，在生理pH值條件下在forestomach，這是約pH 6.0的奶牛。 還已經(jīng)報(bào)道，這些肽是由胃腸道通過的活性（轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)的）和被動(dòng)（旁細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞穿透肽）機(jī)制分兩路吸收。 活動(dòng)路由是由可飽和吸收的肽，而被動(dòng)路由不飽。 此外，激活的路由是溫度敏感的，而被動(dòng)路由不是對(duì)溫度敏感的。 在這項(xiàng)研究中，甘氨酸基-Sar在細(xì)胞中的吸收是受溫度的影響，并是飽和的基板，表明吸收是在肽轉(zhuǎn)運(yùn)部分地介導(dǎo)。 然而，我們的數(shù)據(jù)還表明，甘氨酸基-Sar是通過被動(dòng)路由吸收嗅鞘細(xì)胞，因?yàn)閿z取發(fā)生在4℃，且吸收呈現(xiàn)線性增加，對(duì)應(yīng)的增加的濃度。 我們的動(dòng)力學(xué)測(cè)定也表明，寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表現(xiàn)出高親和力的底物，有效地發(fā)揮作用，在低濃度。
我們的研究還表明，該肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)具有多種底物特異性，因?yàn)榧琢虬彼?- 甘氨酸能有效地抑制甘氨酸基-Sar攝取。 滿足-甘氨酸已被證明是PEPT1的襯底在被轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，并在中國倉鼠卵巢細(xì)胞 ，這進(jìn)一步支持PEPT1在這些肽在嗅鞘細(xì)胞攝取的潛在參與。 在低濃度的Met-Gly組成，以抑制甘氨酸基-Sar攝取50％需要還表明，轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)證明甲硫氨酸 - 甘氨酸的高親和性。 最后，這些研究表明，我們的OEC模式是一個(gè)合適的系統(tǒng)來研究肽轉(zhuǎn)運(yùn)過程中反芻動(dòng)物的forestomach。
總之，我們成功地建立和新生犢牛維持嗅鞘細(xì)胞的原代培養(yǎng)。 培養(yǎng)的細(xì)胞保留了上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)特性。 此外，嗅鞘細(xì)胞也可能占用小肽在體外和攝取依賴于底物濃度，溫度，蛋白質(zhì)，并且可以使用競(jìng)爭(zhēng)者所抑制。 我們還觀察到，PEPT1可以負(fù)責(zé)小肽在嗅鞘細(xì)胞的吸收。 嗅鞘細(xì)胞可以被用作各種營養(yǎng)素，包括小分子肽在牛forestomach的吸收機(jī)制的體外研究中的一種重要模式。
致謝
作者感謝Ilkyu尹博士和鳳起趙博士的有益的討論和修改稿子幫助。 我們也感謝敬群袁女士，農(nóng)業(yè)生物與環(huán)境學(xué)院浙江大學(xué)的技術(shù)人員，在使用實(shí)驗(yàn)設(shè)備提供方便。