徠卡顯微鏡GSDIM 樣品制備- 協(xié)議和技巧
廣角*分辨率技術(shù)GSDIM（基態(tài)耗盡之后個別分子返程）是一個定位顯微鏡技術(shù)，其能夠解決細節(jié)小至20納米。 GSDIM適用于范圍廣泛的樣品。
生長在標準玻璃蓋玻片上的細胞，例如后化學(xué)固定都可以使用。 此外組織切片可為GSDIM來制備并放置在玻璃蓋玻片。 樣品通常是通過熒光免疫染色或其它合適的技術(shù)標記
免疫熒光
與準備與衍射極限的熒光顯微鏡優(yōu)化的標準免疫方案樣品開始應(yīng)該已經(jīng)提供令人驚嘆的*分辨率圖像。 為了獲得*佳的GSD圖片，可能需要增加抗和二抗的濃度，以達到更高的標記密度。 增加標簽密度，確保感興趣的結(jié)構(gòu)充分沾上熒光。 結(jié)構(gòu)稀疏的標簽可能會導(dǎo)致您的圖像的點狀外觀。 為了減少在GSD圖像的非特異性背景信號，它可能需要增加時間用于阻斷樣品以及阻斷試劑的濃度。 這是應(yīng)徹底清洗你的樣品（例如，通過增加洗滌步驟的數(shù)量和時間）。
雙彩屏染色徠卡Microsystems建議一）AlexaFluor 532與AlexaFluor 647，B）AlexaFluor 555與AlexaFluor 647或c）阿托488或AlexaFluor 488與AlexaFluor 647的組合。
圖1：高爾基體膜蛋白Giantin和高爾基體基質(zhì)蛋白GM130，免疫熒光染色的Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 488，分別。 禮貌靖岡田博士，細胞生物學(xué)教研室和解剖，醫(yī)學(xué)研究生院，東京大學(xué)，日本。
圖2：MDCK細胞：微管，AlexaFluor 647（紅色）和TyrMicrotubules，AlexaFluor 488（綠色）。 禮貌教授拉爾夫·雅各布，菲利普斯大學(xué)馬爾堡，德國。
結(jié)構(gòu)保存
一個特定的蜂窩結(jié)構(gòu)體的保存強烈依賴于固定方法。 確切的固定方案，應(yīng)針對感興趣的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化。 對于大多數(shù)結(jié)構(gòu)的多聚甲醛/甲醛固定就足夠了。 除了多聚甲醛/甲醛作為fixant少量戊二醛（0.05％至0.2％（體積/體積））的可強烈提高結(jié)構(gòu)保存。戊二醛可誘發(fā)一種朦朧的熒光背景，因此與銨淬火， 硼氫化鈉或其它合適的試劑推薦。 甲醇固定是很常見的微管保存，但可能不足以為其他結(jié)構(gòu)。
蓋玻片
*分辨率成像需要在整個光學(xué)系統(tǒng)的良好的光學(xué)性能 - 不僅在顯微鏡和物鏡。 蓋玻片是對成像效果高沖擊的主要參數(shù)。 以獲得*佳的*分辨率圖像質(zhì)量的扁平蓋玻片是必需的。
不幸的是，雖然是不加批判的標準廣角應(yīng)用，不是所有的腔蓋玻片的產(chǎn)品可以保證*佳的平整度就GSD的程度。 此外，腔蓋玻片的產(chǎn)品可能不適合高分辨率成像提供必要的機械穩(wěn)定性。 相應(yīng)的產(chǎn)品應(yīng)該由研究員為他們的適應(yīng)性測試。 一個更好的平整度和高穩(wěn)定性可通過在玻璃蓋玻片，例如在特別設(shè)計的蓋玻片持有者的無應(yīng)力安裝通常被實現(xiàn)。
在我們的情況下，我們?yōu)楹唵魏捅馄酵扑]的另一種方法蓋玻片安裝專門用于GSD成像利用高精確度的蓋玻片和硅酮膠來固定和密封所述樣品（參見下文）量身定做。
嵌入
包埋劑 - - 每個熒光團與它的直接環(huán)境相結(jié)合的固有特性決定了基態(tài)損耗的能力，以及對單分子的回報率。 有了它，包埋劑效力于成功的GSD成像至關(guān)重要的作用，并具有與利用熒光對齊。 到現(xiàn)在下面越來越多的機會是適用的。
包埋劑1 - MEA在PBS
試劑
β-巰基乙胺（MEA）（例如，Sigma-Aldrich公司，＃30070，也被稱為半胱胺）
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中
HCl / NaOH調(diào)節(jié)pH調(diào)整
緩沖
PBS中含有10mMβ-巰基乙胺（MEA），調(diào)節(jié)至pH 7.4。 溶解的β-巰基乙胺在PBS中并調(diào)節(jié)至pH 7.4。 β-巰基乙胺的濃度可以改變，在很寬的范圍內(nèi)，以優(yōu)化GSD圖像 - 使用范圍一般是10和100毫米之間（建議濃度為測試31/30/100毫摩爾）。
β-巰基乙胺溶液必須在使用前新鮮配制，另外，儲液可制備并儲存于-20℃并在使用前剛解凍。 冷凍的等分試樣可被存儲在幾個星期。
照明
EPI：是
全內(nèi)反射熒光：是
激光（波長） | 染料 | 生產(chǎn)廠家 |
|---|---|---|
488 | AlexaFluor 488 | 生命技術(shù) |
阿托488 | 西格瑪 | |
做Chromeo 488 | Active Motif | |
俄勒岡綠488 | 生命技術(shù) | |
做Chromeo 505 | Active Motif | |
532 | 阿托520 | 西格瑪 |
AlexaFluor 532 | 生命技術(shù) | |
AlexaFluor 555 | 生命技術(shù) | |
AlexaFluor 568 | 生命技術(shù) | |
642 | 阿托633 | 西格瑪 |
AlexaFluor 647 | ||
阿托647N | 西格瑪 | |
阿托655 | 西格瑪 | |
AlexaFluor 680 | 生命技術(shù) | |
AlexaFluor 700 | 生命技術(shù) |
包埋劑2 - 葡萄糖氧化酶
試劑
葡萄糖氧化酶（如Sigma-Aldrich公司G2133）
過氧化氫酶（如Sigma-Aldrich公司C1345）
葡萄糖
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中
的HCl / NaOH調(diào)節(jié)pH調(diào)整
緩沖
PBS中含有10％（重量/體積）葡萄糖，0.5毫克/毫升葡萄糖氧化和40微克/毫升過氧化氫酶調(diào)節(jié)至pH 7.4。
注：建議準備一個葡萄糖母液和安裝蓋玻片前新鮮混合試劑。
照明
EPI：是
全內(nèi)反射熒光：是
激光（波長） | 染料 | 生產(chǎn)廠家 |
|---|---|---|
532 | 阿托532 | 西格瑪 |
AlexaFluor 532 | 生命技術(shù) | |
AlexaFluor 555 | 生命技術(shù) | |
羅丹明6G | Active Motif | |
阿托565 | 西格瑪 | |
AlexaFluor 568 | 生命技術(shù) | |
642 | 阿托655 | 西格瑪 |
AlexaFluor 680 | 生命技術(shù) |
包埋劑3 - 聚乙烯醇
試劑
聚乙烯醇（PVA）為25000，分子量，88％（摩爾）水解（例如Polysciences的，＃02975-500）
磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中
的HCl / NaOH調(diào)節(jié)pH調(diào)整
硬件
Spincoater
緩沖
制備在PBS中的1％PVA溶液。 將pH調(diào)節(jié)至7.4。
旋涂
將蓋玻片上的spincoater及干燥，短暫5-10秒旋轉(zhuǎn)蓋玻片在約 3000轉(zhuǎn)。 滴50微升的PVA溶液的樣品上并旋轉(zhuǎn)該樣品在約 3000 rpm離心約30秒。 讓該PVA膜干燥幾分鐘并裝載樣品。 可將樣品在室溫下保存，并用于GSD成像長達三個月。
沒有額外的安裝介質(zhì)是必需的。 PVA膜，保護樣品。
照明
EPI：是
TIRF：不可能
激光（波長） | 染料 | 生產(chǎn)廠家 |
|---|---|---|
488 | AlexaFluor 488 | 生命技術(shù) |
阿托488 | 西格瑪 | |
做Chromeo 488 | Active Motif | |
俄勒岡綠488 | 生命技術(shù) | |
阿托520 | 西格瑪 | |
532 | AlexaFluor 532 | 生命技術(shù) |
AlexaFluor 680 | 生命技術(shù) |
包埋劑4 - 的Mowiol
試劑
甘油（分析純）
MOWIOL 4-88（例如Calbiochem公司＃475904）
蒸餾水
三
的HCl / NaOH調(diào)節(jié)pH調(diào)整
包埋劑
開始6克甘油
添加2.4克4-88的Mowiol
添加6毫升水族dest中。
添加12毫升0.2M的Tris緩沖液pH值8
攪拌4小時（磁攪拌器）
讓我們暫停休息2小時
孵育10分鐘，在50℃（水?。?/span>
離心機在5000×g離心15分鐘
取上清液，并在-20℃下凍結(jié)它在等分
照明
EPI：是
TIRF：不可能
激光（波長） | 染料 | 生產(chǎn)廠家 |
|---|---|---|
488 | 阿托488 | 西格瑪 |
做Chromeo 505 | Active Motif | |
532 | AlexaFluor 532 | 生命技術(shù) |
羅丹明6G | Active Motif | |
阿托647N | 西格瑪 | |
642 | 阿托655 | 西格瑪 |
AlexaFluor 700 | 生命技術(shù) |
包埋劑5 - 的Vectashield?
試劑
Vectashield?（如Vector Laboratories公司，＃H-1000）
50牛米三甘油中
HCl / NaOH調(diào)節(jié)pH調(diào)整
緩沖
的50mM Tris /甘油含有緩沖液的10％的Vectashield?調(diào)節(jié)至pH 7.4。
三溶解于甘油準備一個50毫米原液。 混合10％的Vectashield?與90％的Tris /甘油緩沖。 調(diào)節(jié)pH至7.4。 樣本可以被存儲在數(shù)周，在4°C。
照明
EPI：是
TIRF：不可能
激光（波長） | 染料 | 生產(chǎn)廠家 |
|---|---|---|
532 | AlexaFluor 555 | 生命技術(shù) |
642 | AlexaFluor 647 | 生命技術(shù) |
包埋劑的YFP
GSDIM適合創(chuàng)建使用熒光蛋白的*分辨率圖像。 如熒光蛋白YFP /金星***的顯示效果。 此外，其他的熒光蛋白質(zhì)應(yīng)與該技術(shù)（包括GFP）。 要結(jié)合與基因編碼的融合蛋白的優(yōu)點有機熒光電源（例如，如果沒有合適的抗體可用），使用標記，如SNAP-，鹵素或CLIP-標簽建議。 這些標記可以遺傳地與感興趣的蛋白質(zhì)和后標有有機熒光團（例如，固定和透化后）。
下面的水嵌入被成功用于圖像YFP在固定和通透的哺乳動物細胞：
過氧化氫酶SIGMA，C1345 40微克/毫升
葡萄糖氧化酶SIGMA G2133 0.5毫克/毫升
葡萄糖10毫克/毫升
β-巰基乙胺（半胱胺）1毫米
在PBS中稀釋，調(diào)節(jié)至pH 7.4
安裝
徠卡Microsystems建議安裝蓋玻片直接對抑郁癥的幻燈片樣本。 蓋玻片應(yīng)該固定在凹部滑動，并與雙組分硅酮膠Twinsil?（Picodent，維佩菲爾特，德國，＃13001000）密封。 Twinsil?是無毒的，快速硬化，并且可以在稍后容易地除去，例如，重新裝載樣品。
加90微升水包埋培養(yǎng)基（MEA中，葡萄糖氧化酶，混合或的Vectashield?）到一個干凈的抑郁滑動的空腔。
（對于嵌入媒體PVA和LR-白：離開抑郁癥幻燈片的腔體為空。）將您的樣品的玻璃蓋玻片上的抑郁癥幻燈片的腔。 樣品應(yīng)面對腔。 蓋玻片應(yīng)完全覆蓋抑郁癥。
如果水性包埋介質(zhì)被填充在腔體中，確保沒有氣泡存在。 否則，小心地取出蓋玻片，并重復(fù)上述步驟。
無液體應(yīng)該出席的地區(qū)，應(yīng)膠水覆蓋（Twinsil?）。 小心地用濾紙除去殘留的液體。 對于嵌入媒體1，2和5：確保沒有緩沖區(qū)是從水庫浸泡出來。
混合的Twinsil?黃色和藍色分量的1 +1徹底的數(shù)量，并把它應(yīng)用到玻璃蓋玻片的邊緣不直接接觸蓋玻片。
用于水性嵌入媒體：與Twinsil?完全密封蓋玻片。
嵌入媒體PVA和LR-白：密封蓋玻片約。 75％，其余的四分之一開放，允許通風(fēng)，避免對樣品冷凝。5-10分鐘后的雙組分膠硬化和試樣準備GSD成像。
該膠可在不硬化（如交換成像緩沖區(qū)）后不留痕跡在玻璃上很容易地刪除。
AlexaFluor?是生命科技的注冊商標?。
安裝步驟
1）移液管約。 90微升的液體包埋介質(zhì)（例如，MEA溶液）放入凹陷滑動的空腔。 |
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2）將圓形蓋玻片 - 抱著免疫染色樣品 - 到介質(zhì)上，并避免氣泡的形成。 |
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3）輕輕按壓在蓋玻片，以去除氣泡（如有必要）和過量的緩沖液。 |
| 混合使用這兩種成分- Twinsil硬化?開始混合。 | |
4）小心地取出液體不從抑郁癥幻燈片水庫浸泡緩沖區(qū)。 |
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5）通過仔細地適用Twinsil?密封蓋玻片。 請勿觸摸或移動蓋玻片！ |
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6）當(dāng)硬化（約5分鐘）Twinsil?是輕輕地用尖感動，也不會粘也不能推到一邊。 |
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影像學(xué)提示
雙色染色
徠卡推薦的組合
一）AlexaFluor 532與AlexaFluor 647
二）AlexaFluor 555與AlexaFluor 647
三）阿托488或AlexaFluor 488與AlexaFluor 647
對于連續(xù)雙彩色成像。 請先圖像的紅色通道（AlexaFluor 647）。 徠卡不建議在開始成像綠色/橙色通道（如AlexaFluor 532），以避免AlexaFluor 647，它可以是漂白 - 雖然在非常低的水平 - 興奮由488納米（或532 nm）的激光。 如果打算使用其它熒光團為雙染色的樣品時，請確認這兩個熒光團可以相同GSD成像條件（包埋介質(zhì)）下進行成像和串?dāng)_是微不足道的。
圖3：PTK2細胞AlexaFluor 647染色的微管在綠色紅色和AlexaFluor 488染色網(wǎng)格蛋白。 禮貌教授斯特凡地獄，馬克斯 - 普朗克生物物理化學(xué)研究所，哥廷根，德國。
利用405 nm激光
徠卡SR GSD配備一個405nm的激光器。 在關(guān)斷狀態(tài)的熒光團的壽命可以通過用UV光還照射樣本被縮短。 較短的壽命會導(dǎo)致導(dǎo)通狀態(tài)的增加熒光基團，因此可用于增加每幀檢測到的事件的數(shù)目。 通過保持每幀的事件在一個*佳的范圍內(nèi)的數(shù)，可以是a）有效地檢測分離良好的單熒光團和b）保持獲得的*分辨率圖像短的時間，因為它有可能積聚所需數(shù)量更少的圖像內(nèi)的事件。
當(dāng)獲得雙彩色圖像的較長波長信道，必須小心使用405 nm激光是很重要的！ 在405nm的波長可激發(fā)的綠色染料，因此漂白較短波長的熒光基團而獲得的較長波長的*分辨率圖像。 *佳設(shè)置應(yīng)分別為每個樣品類型而定。
活細胞*分辨率成像
*近的報道已經(jīng)研究GSDIM（也稱為dSTORM）的圖像的活細胞中的適用性。 在一般情況下，它是可能的，研究活細胞與Leica SR GSD，而是光毒性 - 如所施加的高功率激光的結(jié)果 - 和感興趣的觀察期內(nèi)結(jié)構(gòu)的動力學(xué)應(yīng)仔細控制。