在過去的十年里，各種簡單和復(fù)雜的算法已經(jīng)發(fā)展到協(xié)助顯微鏡在從數(shù)字圖像去除模糊。 *普遍使用的算法的卷積在光學(xué)顯微鏡可分為兩大類： 去模糊和圖像復(fù)原 。 去模糊算法基本上二維的，因?yàn)樗鼈冞m用于操作面，由面內(nèi)的每個(gè)二維三維圖像棧的平面。 與此相反，因?yàn)樗鼈冊(cè)谝粋€(gè)三維圖像堆棧同時(shí)操作上的每一個(gè)像素的圖像恢復(fù)算法被適當(dāng)?shù)胤Q為“三維”。

在繼續(xù)之前，有幾個(gè)專業(yè)術(shù)語必須被定義。 的對(duì)象指的是光在視顯微鏡的字段由熒光發(fā)射結(jié)構(gòu)的三維圖案。RAW圖像是指從顯微鏡獲得的未處理的數(shù)字圖像或圖像棧。 的圖像中感興趣的特定區(qū)域被稱為特征 。

去模糊算法

雖然通常被稱為近鄰 ， 多鄰居 ， 無鄰居 ，和反銳化掩模常用算法基本上是二維的，它們被歸類為這個(gè)討論， 去模糊算法的目的。 作為一類，這些算法適用于操作面，由面內(nèi)的每個(gè)二維三維圖像棧的平面。 例如，*近鄰算法運(yùn)行在z平面通過模糊相鄰平面（Z + 1和z - 1，用數(shù)字模糊濾波器），然后從z平面中減去模糊的平面。 多鄰居的技術(shù)擴(kuò)展這個(gè)概念飛機(jī)的用戶可選擇的數(shù)字。 一種三維堆疊是通過應(yīng)用該算法的每一個(gè)平面的協(xié)議棧進(jìn)行處理。 在這種方式中，模糊的估算值是從每個(gè)平面中移除。 圖1給出了從光學(xué)部分的三維堆疊中選擇一個(gè)單一的焦平面，前處理（圖1（a）），以及去卷積通過*近鄰算法（圖1（b））之后。 從非洲爪蟾的制備細(xì)胞染色微管購入的數(shù)據(jù)。

去模糊算法是計(jì)算經(jīng)濟(jì)，因?yàn)樗鼈兩婕皩?duì)單個(gè)圖像平面表現(xiàn)相對(duì)簡單的計(jì)算。 但是，有幾個(gè)主要的缺點(diǎn)這些方法。 首先，從幾架飛機(jī)噪聲相加。 第二，去模糊算法去除模糊的信號(hào)，從而降低整體信號(hào)電平。 三，功能特點(diǎn)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)特別z平面重疊可在飛機(jī)，他們并不真正屬于進(jìn)行銳化（實(shí)際上，特征明顯位置可能會(huì)改變）。 去模糊單個(gè)二維圖像時(shí)，因?yàn)樗鼈兂３０瑏碜詫⒈幌骷?，好像他們是在焦平面上的其它結(jié)構(gòu)的衍射環(huán)或輕這一問題尤為嚴(yán)重。 綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明，去模糊算法提高對(duì)比度，但他們這樣做在降低信號(hào)噪聲比為代價(jià)，也可能引入的圖像中的結(jié)構(gòu)構(gòu)件。

二維去模糊算法可能是在一個(gè)快速去模糊操作是必要的，或當(dāng)電腦的電源是有限的情況下非常有用。 這些例程在具有熒光結(jié)構(gòu)離散分布，特別是在z軸標(biāo)本效果*好。 然而，簡單的去模糊算法誘導(dǎo)像素的相對(duì)強(qiáng)度偽跡的變化，應(yīng)謹(jǐn)慎（或*好，一點(diǎn)都適用），以目的地為形態(tài)的測(cè)量，定量熒光強(qiáng)度測(cè)量，并且強(qiáng)度比計(jì)算的圖像被應(yīng)用。

圖像復(fù)原算法

在反卷積顯微圖像復(fù)原算法的主要功能是處理模糊的三維問題。 而不是減去模糊的，他們?cè)噲D重新分配模糊的光，以適當(dāng)?shù)膶?duì)焦位置。 這是通過反轉(zhuǎn)所固有的成像系統(tǒng)中的卷積運(yùn)算進(jìn)行的。 如果成像系統(tǒng)被建模為與點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的對(duì)象的卷積，然后將原始圖像的去卷積應(yīng)該恢復(fù)的對(duì)象。 然而，該對(duì)象不能被完全因?yàn)楣逃械某上裣到y(tǒng)的基本限制和圖像形成模型的恢復(fù)。 可以做的*好的是估計(jì)給定的這些限制的對(duì)象。 恢復(fù)算法估計(jì)的對(duì)象，以下，該對(duì)象的一個(gè)好的估計(jì)是1，當(dāng)與點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的卷積，產(chǎn)生原始圖像的邏輯。

此制劑的優(yōu)點(diǎn)在于，在大矩陣（如三維圖像棧）的卷積操作，可以計(jì)算非常簡單地使用傅立葉變換的數(shù)學(xué)技術(shù)。 如果圖像與點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)被變換成傅立葉空間中 ，該圖像由點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的卷積可以簡單地乘以它們的傅立葉變換來計(jì)算。 然后將得到的傅立葉圖像能重新轉(zhuǎn)化成真實(shí)的三維坐標(biāo)。

逆濾波算法

待開發(fā)的*個(gè)圖像去卷積算法被稱為逆濾波器 。 這種過濾器，隨著他們的堂兄弟的正規(guī)化逆濾波器 ，已自20世紀(jì)60年代受聘于電子信號(hào)處理，并首次應(yīng)用到圖像上世紀(jì)70年代末。 在大多數(shù)圖像處理軟件程序，這些算法去了各種各樣的名字，包括維納去卷積 ， 正則化*小二乘法 ， 線性*小二乘 ，和吉洪諾夫-米勒正規(guī)化 。

通過拍攝圖像的傅立葉變換，并通過傅立葉分割的逆濾波器函數(shù)變換的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的。 因?yàn)樵诟盗⑷~空間中劃分是反卷積在實(shí)際空間中的等價(jià)物，這是為了扭轉(zhuǎn)產(chǎn)生的模糊圖像的卷積的*簡單的方法。 的計(jì)算是快速的，約快如上面所討論的二維去模糊的方法。 然而，這種方法的實(shí)用性是由噪聲放大的限制。 在傅立葉空間劃分，在傅立葉噪音小的變化變換通過除法運(yùn)算放大。 其結(jié)果是，模糊消除受到損害作為對(duì)在噪聲增益的折衷。 此外，被稱為振鈴神器可以推出。

噪聲放大和振蕩可以通過使左右，導(dǎo)致了該圖像的對(duì)象的結(jié)構(gòu)的一些假設(shè)被減小。 例如，如果對(duì)象被認(rèn)為是相對(duì)平滑的，嘈雜的解決方案具有粗糙的邊緣可以被消除。 這種方法被稱為正規(guī)化 。 正則逆濾波器可以被描述為適用某一種約束就可能估計(jì)，給出關(guān)于對(duì)象的一些假設(shè)的統(tǒng)計(jì)估算：在這種情況下，平滑度。 在光滑的約束使得算法來選擇一個(gè)合理的估計(jì)出大量可能出現(xiàn)，因?yàn)樵胍糇儺惪赡芄烙?jì)。

正則可以在一個(gè)步驟中施加于逆濾波，或者可以重復(fù)地被應(yīng)用。 其結(jié)果通常是平滑（剝離了更高的傅立葉頻率）。 多的圖像中被移除的“粗糙度”的發(fā)生在傅立葉頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)*出了分辨率極限，因此，該方法不消除記錄的顯微鏡的結(jié)構(gòu)。 然而，因?yàn)橛性敿?xì)的損失的電位，反向?yàn)V波器的軟件實(shí)現(xiàn)通常包括一個(gè)可調(diào)節(jié)的參數(shù)，使得控制平滑和噪聲放大之間的折衷的用戶。

約束迭代算法

為了提高逆濾波器的性能，各種附加的三維算法可以應(yīng)用于圖像恢復(fù)的任務(wù)。 這些方法被統(tǒng)稱為約束的迭代算法 ，并工作在連續(xù)循環(huán)（因此，術(shù)語“迭代”）。 此外，這些算法通常也適用于可能的解決方案，這不僅有利于減少噪聲和其他失真，而且還增加了電源恢復(fù)模糊信號(hào)的限制。

一個(gè)典型的約束迭代算法操作如下。 首先，對(duì)象的初始估計(jì)被執(zhí)行，它通常是將原始圖像本身。 估計(jì)，然后用點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的卷積，和由此產(chǎn)生的“模糊預(yù)測(cè)”與原來的原始圖像進(jìn)行比較。 這種比較是用來計(jì)算，代表有類似的模糊估計(jì)是原始圖像的誤差標(biāo)準(zhǔn)。 通常被稱為品質(zhì)因數(shù) ，該誤差準(zhǔn)則，然后用于改變的估計(jì)值以這樣一種方式，該誤差減小。 一種新的迭代然后發(fā)生：新的估計(jì)是卷積的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，一個(gè)新的誤差準(zhǔn)則計(jì)算，依此類推。 *佳估計(jì)將是一個(gè)*小化的誤差標(biāo)準(zhǔn)。 作為算法的進(jìn)行，每次誤差準(zhǔn)則被確定為不被*小化時(shí)，新的估算，再次模糊，誤差準(zhǔn)則重新計(jì)算。 重復(fù)整個(gè)過程，直到誤差準(zhǔn)則*小化或達(dá)到定義的閾值。 *終恢復(fù)的圖象可以是在*后一次迭代的對(duì)象的估計(jì)。

在圖2中所給出的數(shù)據(jù)從含有70光學(xué)切片的三維圖像堆棧被采納，并通過單一XLK2細(xì)胞記錄，以0.2微米的間隙。 一個(gè)寬視場成像系統(tǒng)，搭載了高數(shù)值孔徑（1.40）油浸物鏡，被用來采集圖像。 左側(cè)圖像（圖2（a）所示，標(biāo)記的原始數(shù)據(jù) ）是從三維堆疊采取任何數(shù)據(jù)處理的應(yīng)用程序之前，單個(gè)焦平面中。 通過去模糊*近鄰點(diǎn)算法產(chǎn)生的圖像中顯示的結(jié)果標(biāo)記為*近鄰 （圖2（b））。 第三圖像（圖2（c）中， 老式 ）示出恢復(fù)由一個(gè)商業(yè)銷售約束的迭代解卷積軟件產(chǎn)品的結(jié)果。 既去模糊和恢復(fù)提高對(duì)比度，但在信號(hào)與噪聲的比率是顯著較低的去模糊的圖像比在恢復(fù)圖像。 在圖2（c）中的標(biāo)尺表示2微米的長度，并且將箭頭（圖2（a））表示的線圖在圖4中呈現(xiàn)的位置。

大部分的算法目前應(yīng)用于光學(xué)圖像的反卷積從顯微鏡納入約束允許的估計(jì)范圍。 通常使用的約束被平滑化或正則化，如上面所討論的。 隨著迭代過程中，算法將趨于放大噪音，因此大多數(shù)實(shí)現(xiàn)抑制這種與平滑或正則過濾器。

另一種常見的限制是非負(fù)性 ，這意味著，在估計(jì)該迭代過程中變?yōu)樨?fù)的任何像素值被自動(dòng)設(shè)置為零。 像素值經(jīng)?？梢宰兂韶?fù)的算法中進(jìn)行傅立葉變換或減法運(yùn)算的結(jié)果。 非負(fù)約束是現(xiàn)實(shí)的，因?yàn)閷?duì)象不能有負(fù)面的熒光。 它本質(zhì)上是可能的估計(jì)值約束，考慮到我們的對(duì)象的結(jié)構(gòu)的知識(shí)。 其它類型的約束，包括邊界約束的像素飽和，對(duì)噪聲統(tǒng)計(jì)的約束，和其他統(tǒng)計(jì)的約束。

經(jīng)典算法約束迭代反卷積

約束迭代反卷積算法，在顯微鏡拍攝的圖像中*個(gè)應(yīng)用程序是基于對(duì)楊松-范Cittert（JVC）的算法，首先開發(fā)用于光譜應(yīng)用程序的過程。 阿加德后來在一個(gè)具有里程碑意義的一系列調(diào)查修改這個(gè)算法的數(shù)字顯微鏡圖像分析。 商業(yè)公司如Vaytek，智能成像創(chuàng)新，應(yīng)用精密，卡爾蔡司，和位面目前市場阿加德的改進(jìn)算法的各種實(shí)現(xiàn)。 此外，幾個(gè)研究小組已經(jīng)開發(fā)已經(jīng)銷售的Vaytek和Scanalytics一個(gè)正規(guī)化的*小二乘方*小化方法。 這些算法利用一個(gè)加法或乘法誤差準(zhǔn)則來更新估計(jì)在每一次迭代。

統(tǒng)計(jì)迭代算法

迭代算法的另一個(gè)家庭使用從統(tǒng)計(jì)理論。 可能性 ，概率的反向變化，采用*大似然估計(jì)（MLE），并期望*大化（EM）借來概率誤差準(zhǔn)則由SVI，位平面，即興，卡爾實(shí)施市售算法蔡司和Autoquant。 *大似然估計(jì)是在科學(xué)的許多分支應(yīng)用的普及統(tǒng)計(jì)工具。 一個(gè)相關(guān)的統(tǒng)計(jì)度量，*大熵（ME -不要與期望值*大化，EM混淆）已經(jīng)在圖像去卷積實(shí)施由卡爾蔡司。

統(tǒng)計(jì)算法比傳統(tǒng)方法更密集計(jì)算，可以采取顯著更長的時(shí)間才能達(dá)成解決方案。 然而，他們可能圖像還原到稍高程度的分辨率的比經(jīng)典的算法。 這些算法也有它們強(qiáng)加給預(yù)期的噪聲統(tǒng)計(jì)（實(shí)際上，泊松或高斯分布）的限制的優(yōu)點(diǎn)。 因此，統(tǒng)計(jì)算法比單純的正則更為微妙的噪音政策，以及它們可能產(chǎn)生的噪聲圖像效果更佳。 然而，適當(dāng)?shù)脑肼暯y(tǒng)計(jì)的選擇可能依賴于成像條件，以及一些商業(yè)軟件包比其他人在這方面更加靈活。

盲解卷積算法

盲解是一個(gè)相對(duì)較新的技術(shù)，大大簡化了反褶積的應(yīng)用對(duì)于非專業(yè)，但該方法尚未廣泛使用在商業(yè)領(lǐng)域。 該算法通過改變*大似然估計(jì)過程，這樣不僅上述目的，但也點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)估計(jì)開發(fā)。 使用這種方法時(shí)，對(duì)象的初始估計(jì)是由與估計(jì)，然后與從所述成像系統(tǒng)的光學(xué)參數(shù)計(jì)算得到的理論點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的卷積。 所得到的模糊估算是與原始圖像相比，進(jìn)行校正計(jì)算，并且該修正被利用來產(chǎn)生一個(gè)新的估計(jì)，如上所述。 此相同的校正也適用于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，生成一個(gè)新的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的估計(jì)。 在進(jìn)一步的迭代，點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)估計(jì)和預(yù)測(cè)對(duì)象一起更新。

盲解工作得很好，不僅對(duì)高品質(zhì)的圖像，還對(duì)噪聲的圖像或來自球面像差的痛苦。 該算法與理論點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的開始，但它適應(yīng)于特定的數(shù)據(jù)被卷積。 在這方面，它免去了用戶從實(shí)驗(yàn)獲得了高品質(zhì)的經(jīng)驗(yàn)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的艱難過程。 此外，由于算法調(diào)整的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的數(shù)據(jù)時(shí)，它可以部分地校正球面像差。 然而，這種計(jì)算校正應(yīng)該是*后的手段，因?yàn)樗歉鼮榭扇〉膱D像采集過程中盡量減少球面像差。

采用三種不同的處理算法，以相同的數(shù)據(jù)集的結(jié)果示于圖3。 原來的三維數(shù)據(jù)是用廣角熒光顯微鏡（1.25 NA油浸物鏡）0.4微米的z軸的步驟獲得了果蠅胚胎腿192的光學(xué)部分。 該圖像表示從所述三維堆疊中選擇一個(gè)單一的光學(xué)部分。 原始（原始）圖像示于圖3（a）所示。 去模糊的一個(gè)近鄰算法，結(jié)果將顯示在圖3（b），與灰霾去除95％的設(shè)置處理參數(shù)。 去卷積之后的同一圖像切片示出由逆（維納）濾波器（圖3（c）），并通過迭代盲解卷積（圖3（d）），摻入一種自適應(yīng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的方法。

共聚焦和多圖像解卷積

如可預(yù)期的，但也可以用來恢復(fù)用共焦或多光子光學(xué)顯微鏡獲得的圖像。 共聚焦顯微鏡和反褶積技術(shù)的結(jié)合提高了*出一般可達(dá)到與單獨(dú)的技術(shù)解析。 然而，解卷積共聚焦圖像的主要好處是沒有那么多的重新分配，作為出焦光，從而導(dǎo)致降低噪聲平均。 多光子圖像的去卷積也被成功地用于去除圖像失真和提高對(duì)比度。 在所有這些情況下，必須小心將適當(dāng)?shù)狞c(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，尤其是當(dāng)共焦針孔孔徑是可調(diào)節(jié)的。

解卷積算法的實(shí)現(xiàn)

處理速度和質(zhì)量顯著影響，如何在給定去卷積算法由軟件來實(shí)現(xiàn)。 該算法可以的方式，減少迭代次數(shù)，加快融合，以產(chǎn)生穩(wěn)定的估計(jì)行使。 例如，未優(yōu)化楊松-范Cittert算法通常在50和100之間的迭代需要收斂到一個(gè)*佳的估計(jì)。 由預(yù)濾波的原始圖像，以抑制噪聲并與所述*2次迭代的附加誤差校正標(biāo)準(zhǔn)，算法收斂在僅5至10次迭代。 此外，平滑濾波器，通常引入每5次迭代，以減少噪聲的放大。

當(dāng)使用一個(gè)經(jīng)驗(yàn)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，使用噪點(diǎn)極少的高品質(zhì)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)是至關(guān)重要的。 無反褶積包目前在市場上使用直接從顯微鏡記錄“原始”的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。 相反，該包包含前處理例程，降低噪聲并執(zhí)行徑向?qū)ΨQ性通過計(jì)算點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的傅里葉變換。 許多軟件包也執(zhí)行軸對(duì)稱的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，因此假設(shè)不存在球面像差。 這些步驟降低噪聲和畸變，并使得在修復(fù)體的質(zhì)量有很大的差異。

去卷積算法的實(shí)現(xiàn)的另一個(gè)重要方面是將原始圖像的預(yù)處理，通過例程，如背景減除，平場校正，漂白校正，和燈的抖動(dòng)校正。 這些操作可以提高信號(hào)噪聲比和消除某些類型的文物。 大多數(shù)商用軟件包包括這樣的操作，用戶手冊(cè)應(yīng)征詢其實(shí)施的具體方面的詳細(xì)說明。

其他卷積算法實(shí)現(xiàn)問題的關(guān)注數(shù)據(jù)表示。 圖像可以被劃分為子卷或表示為整個(gè)數(shù)據(jù)塊。 個(gè)別的像素值可以被表示為整數(shù)或浮點(diǎn)數(shù)。 傅里葉變換可以表示為浮點(diǎn)數(shù)或復(fù)數(shù)。 在一般情況下，更忠實(shí)的數(shù)據(jù)表示，去卷積的圖像需要更多的計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器和處理器時(shí)間。 因此，存在計(jì)算速度和恢復(fù)的質(zhì)量之間的折衷。

結(jié)論

迭代恢復(fù)算法從兩個(gè)去模糊算法和共聚焦顯微鏡，因?yàn)樗鼈儾粍h除失焦的模糊，而是試圖將其重新分配到正確的圖像平面不同。 以這種方式，出焦信號(hào)被利用，而不是被丟棄。 恢復(fù)后，熒光結(jié)構(gòu)內(nèi)的像素強(qiáng)度增加，但是每個(gè)圖像堆棧的總相加強(qiáng)度保持不變，如在以前的模糊區(qū)域的強(qiáng)度減弱。 模糊在對(duì)象的周圍的細(xì)節(jié)發(fā)生向回移動(dòng)到焦點(diǎn)，從而導(dǎo)致從背景的對(duì)象和更分化的更詳細(xì)的定義。 更好的對(duì)比度和更高的信號(hào) - 噪聲比，也通常在同一時(shí)間完成。

這些性能示于圖2中，在那里它被證實(shí)恢復(fù)提高了圖像的對(duì)比度，并隨后使更高分辨率的對(duì)象，而不發(fā)生在去模糊方法引入噪聲。 或許更重要的是用于圖像分析和定量，在原始圖像中的熒光信號(hào)的總和是相同的，在去卷積圖像。 當(dāng)正確實(shí)施，圖像復(fù)原方法保持總信號(hào)強(qiáng)度卻提高了調(diào)整的信號(hào)位置（圖4）的對(duì)比。 因此，恢復(fù)圖像的定量分析是可能的，并且，由于改進(jìn)的對(duì)比度，經(jīng)常期望的。

圖形化的情節(jié)在圖4中給出表示（線的位置在圖2中箭頭所示方向（一））沿橫線穿過圖2中所示的單元的像素的亮度值。 原始數(shù)據(jù)由綠線，由藍(lán)線的去模糊的圖像數(shù)據(jù)，并通過紅線的恢復(fù)圖像數(shù)據(jù)表示。 在數(shù)據(jù)是顯而易見的，去模糊引起顯著損失像素強(qiáng)度在整個(gè)圖像，而恢復(fù)結(jié)果中強(qiáng)度的試件的細(xì)節(jié)的區(qū)域的增益。 圖像強(qiáng)度的類似損失所看到的去模糊方法發(fā)生任何二維濾波器的應(yīng)用。

當(dāng)與廣角鏡配合使用，迭代重建技術(shù)是光效。 這個(gè)方面是*有價(jià)值的光限定的應(yīng)用，如高清晰度熒光成像，其中對(duì)象通常是小的，并且包含少量的熒光基團(tuán)，或在活細(xì)胞熒光成像，其中曝光時(shí)間是由活細(xì)胞的極端敏感性，光毒性的限制。