我們都知道，熒光顯微照片揭示了在組織中的分子標(biāo)記的位置，對(duì)不對(duì)？好吧，也許不是。 事實(shí)上，你可以很確定，在熒光模式大多數(shù)激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)量的是在某一特定時(shí)間所收集的光子數(shù)的某些功能。 我們希望這是一個(gè)或兩個(gè)有趣的參數(shù)的精確測(cè)量 - 局部分析物的濃度或局部離子濃度。 事實(shí)上，許多因素會(huì)影響實(shí)際存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中在任何給定時(shí)刻的數(shù)值。

一個(gè)通用的激光掃描共聚焦顯微鏡示出了一些在本文中提及的“39”特征的位置的流程圖示于圖1。 示的系統(tǒng)是基于配置為活細(xì)胞成像的倒置光學(xué)顯微鏡。 在下面的文本稱為單個(gè)組件被標(biāo)記為與至（g）的字母（a）所示。 該圖示包括三個(gè)光學(xué)部分，在不同的高度，通過(guò)抗體標(biāo)記的果蠅胚胎采取沿z軸，并指定Z1，Z2和Z3。

多年來(lái)，學(xué)生參加活細(xì)胞的三維顯微各月期間舉行，英屬哥倫比亞大學(xué)，編譯這些外在因素的清單。 在*年中，列表增加至39項(xiàng)，所以我們借用了希區(qū)柯克電影的名字為我們的名單。此后，名單繼續(xù)成長(zhǎng)！ （在球場(chǎng)上的更多信息可以在網(wǎng)絡(luò)上在被發(fā)現(xiàn)的3-D顯微鏡課程公告板 ）。

雖然這篇文章不能完全描述每個(gè)學(xué)期，短暫的和有用的解釋也包括在內(nèi)。 該條款出現(xiàn)在粗體字和粗體字等許多方面交互。 請(qǐng)注意，許多這些變量通常是在其對(duì)空間分辨率的影響來(lái)考慮的。 他們?cè)谶@里列出來(lái)，因?yàn)榻档偷姆直媛兽D(zhuǎn)換成“把精彩的光子數(shù)相同到一個(gè)更大點(diǎn)”。 這降低了激發(fā)強(qiáng)度 - 通過(guò)給定的分子中產(chǎn)生的光子的數(shù)目 - 和這些檢測(cè)到的級(jí)分。 人們常常忘記，在熒光共聚焦顯微鏡正常信號(hào)電平對(duì)應(yīng)于只有10-20光子/像素的亮區(qū)域。 在這種情況下，統(tǒng)計(jì)噪聲是空間分辨率比由阿貝式定義的更重要的局限：

dmin = λ0 / (NAobj + NAcond)

在公式中，D（分）表示在一個(gè)周期光柵，可以只是被解析的*小間距，并且被表示為在試樣空間橫向距離，λ（0）為光的波長(zhǎng)在真空;和NA(obj)和NA(cond)是的物鏡和聚光透鏡的數(shù)值孔徑，分別。 該方程確定了物鏡和聚光鏡的數(shù)值孔徑在確定圖像分辨率為光的給定波長(zhǎng)的作用。

激光單元 （圖1（a））是照明光源，并且在一般情況下，測(cè)得的熒光是成正比的激光功率電平。 雖然總的激光輸出功率通常調(diào)節(jié)，功率是在多行激光的每一行的值可能無(wú)法，也可以廣泛地隨時(shí)間變化。 波長(zhǎng)影響光學(xué)性能，而且通過(guò)該染料的吸收光譜，它決定了熒光的產(chǎn)生量。

功率輸出不穩(wěn)定通常是噪音，它的不穩(wěn)定性通常小于1％，但隨著年齡的激光可以變得越來(lái)越不穩(wěn)定。 因?yàn)榛覊m，未對(duì)準(zhǔn)，或機(jī)械不穩(wěn)定性可導(dǎo)致10-30％的隨機(jī)變化， 光學(xué)耦合到所述連接光纖（如果使用的話）是至關(guān)重要的效率 。

激光反射鏡對(duì)準(zhǔn)和反射特性可以是長(zhǎng)期漂移在源代碼中的激光輸出。 由于激光的光源是由激 光反射鏡來(lái)確定， 波束指向誤差和/對(duì)齊是很重要的。 不穩(wěn)定這里將顯示為亮度變化，因?yàn)樽兓囊曉谠吹奈恢脤⒏淖凂詈霞す夤饩€進(jìn)入單模光纖中大多數(shù)儀器中使用的光學(xué)器件的效率。

物鏡 （圖1（b））的數(shù)值孔徑的影響通過(guò)可收集樣品發(fā)出的光的分?jǐn)?shù)。 這也適用于光從激光。

物鏡放大倍率是負(fù)相關(guān)的物鏡入射光瞳的直徑。 該目標(biāo)將只有正常工作，如果整個(gè)入瞳充滿了令人興奮的激光。 填充不足會(huì)降低空間分辨率和強(qiáng)度的峰值。 載入過(guò)多會(huì)引起一些激光罷工客觀的金屬安裝和丟失，也減少了光斑的強(qiáng)度。

清潔度是很重要的，并且臟光學(xué)產(chǎn)生更大和調(diào)光斑點(diǎn)。 傳輸 （光入射，可以聚焦到一個(gè)點(diǎn)上它的另一側(cè)的物鏡的分?jǐn)?shù)）隨波長(zhǎng)而變化。 提防使用一些較新的，多層光學(xué)在紅外范圍內(nèi)的。 色差和球面像差都使光斑變大，并且隨波長(zhǎng)。 此外，球面像差與蓋玻片的厚度和浸漬并包埋介質(zhì)的折射率變化很大。

衍射是不可避免的限制的光學(xué)分辨率。 它有效地放大物體比衍射極限較小的圖像，使它們顯得暗淡比他們應(yīng)該的。

掃描系統(tǒng) （圖1（c）），尤其是縮放倍率的控制，決定了一個(gè)象素中的試樣的尺寸。 對(duì)于Nyquist采樣，像素應(yīng)該比你希望看到在你的樣品的*小功能小至少兩次。 假設(shè)200納米的瑞利準(zhǔn)則的分辨率，像素應(yīng)該是小于100納米。 較大的生產(chǎn)欠，減少小功能所記錄的亮度。

漂白率的影響正比于變焦倍率的平方。 為掃描速度 ，較長(zhǎng)的停留時(shí)間在一個(gè)特定的像素，所述多個(gè)信號(hào)將被檢測(cè)到，并在減它將由泊松噪聲失真。 在高掃描速度下（小于100毫微秒/像素），從染料的熒光衰減常數(shù)的長(zhǎng)度*過(guò)這一停留時(shí)間信號(hào)可以被減少。

光柵尺寸 -連同變焦倍率，沿著柵格的邊緣像素的數(shù)目將確定的像素尺寸。 更多的像素（1024×1024與512×512），使欠采樣的可能性較小，但意味著一個(gè)人必須要么花費(fèi)更少的時(shí)間在每個(gè)像素通過(guò)減少收集光子的數(shù)量，增加泊松噪聲，或需要更多的時(shí)間來(lái)掃描大圖和可能導(dǎo)致更多的漂白。 光學(xué)或掃描鏡可以引入幾何失真 ，可能導(dǎo)致物體的形狀和所述圖像之間的不一致。 環(huán)境是很重要的：振動(dòng)和雜散電磁場(chǎng)可以通過(guò)多種設(shè)備引起的，例如，冷卻風(fēng)扇。這可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生扭曲，可能會(huì)隨時(shí)間變化不正當(dāng)鏡偏轉(zhuǎn)。

其他光學(xué)元件包括傳輸 ，它描述不存在于光學(xué)元件，特別是中性密度或帶通濾波器，分束器和目標(biāo)的吸收和反射損失的量度。 思考從空氣/玻璃界面通常表示丟失的信號(hào)，但可能會(huì)出現(xiàn)亮點(diǎn)無(wú)關(guān)樣本結(jié)構(gòu)。 鏡面反射率可以是波長(zhǎng)的強(qiáng)功能的紅外線和紫外線，并降低暴露在潮濕和灰塵。

蓋玻片的厚度是*昂貴的光學(xué)組件和*有可能被不小心選擇。 它應(yīng)該是170±5微米的厚度。作為浸油 ，其折射率必須完全匹配所用的物鏡。 這可能只發(fā)生在一個(gè)小的溫度范圍內(nèi)，以及可選地，它可以是自定義的混合。 聚焦平面上的位置是重要的，因?yàn)槁愿哂诨蚪裹c(diǎn)的平面之下的特征會(huì)出現(xiàn)比在焦點(diǎn)平面的特征的調(diào)光器。 當(dāng)收集的三維數(shù)據(jù)，奈奎斯特采樣，還必須實(shí)行的z軸的平面的間隔。 *后， 該階段的機(jī)械漂移可導(dǎo)致實(shí)際成像隨時(shí)間變化的對(duì)象的平面。

感興趣的染料的濃度可能是你正在試圖測(cè)量。 滲透入試樣往往是離子強(qiáng)度和pH值的函數(shù)（或從空間排阻）是什么。 的吸收截面是令人興奮的光子通量，這將通過(guò)染料分子被吸收的分?jǐn)?shù)的測(cè)量。 它是由共軛探頭，pH值，特定離子的濃度和離子強(qiáng)度的方法的影響。

量子效率描述了機(jī)會(huì)，能量從一個(gè)激動(dòng)人心的光子吸收將被重新輻射的熒光光子。 它是波長(zhǎng)的強(qiáng)函數(shù)，并且還受pH值，特定的離子濃度，離子強(qiáng)度和染料-蛋白質(zhì)相互作用。當(dāng)激光功率大于1毫瓦使用具有高數(shù)值孔徑的物鏡時(shí)單線態(tài)飽和 。 然后，光的強(qiáng)度足以將大部分接近交叉的染料分子進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，從而減少了有效的染料的量子效率。

裝載是指染料的你把你的細(xì)胞數(shù)量。 重要的變量包括染料分子/抗體的數(shù)量，或者其它蛋白質(zhì)標(biāo)記，并用于固定/透化協(xié)議。 猝滅是由附近的其他人從1染料分子發(fā)出的熒光的吸收。 卸載是指染料，這是在細(xì)胞內(nèi)，但是現(xiàn)已泵出或以其它方式失活。

底物反應(yīng)的稅率適用于染料與那些與他們的互動(dòng)與細(xì)胞離子或其他分子的熒光性質(zhì)。 像素的駐留是微秒數(shù)量級(jí)上，因此有可能沒(méi)有足夠的時(shí)間以達(dá)到平衡。 預(yù)漂白是指染料的脫色本測(cè)定之前進(jìn)行即可。

條塊是染料的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程的重新分配。 染料/染料的相互作用不僅指剛才提到的淬火，而且還對(duì)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。 發(fā)生這種情況時(shí)，一種染料的發(fā)射光譜與第二染料分子的吸收光譜重疊，幾納米的路程。FRET可導(dǎo)致光的僅在第二染料的發(fā)射波長(zhǎng)的發(fā)射。 如果第二分子不是熒光的，如通常發(fā)生的，熒光丟失或淬滅。 染料對(duì)試樣的影響，可能會(huì)影響許多環(huán)境變量，包括樣品的生存力的降低。

試樣 （圖1（d））和它的嵌入介質(zhì)的折射率，將決定的球面像差存在的嚴(yán)重程度。 即使是觀看使用水目標(biāo)水生物標(biāo)本，對(duì)手是不可能做到**，甚至接近。 這種類型的球面像差是隨著穿透深度的信號(hào)損失的主要原因。

它必須使用的浸油具有正確的折射率和色散（與波長(zhǎng)的折射率的變化）。 同時(shí)，要確保沒(méi)有氣泡，將作為在沉浸介質(zhì)中間的鏡頭。 檢查通過(guò)集中上下同用于調(diào)整你相環(huán)的勃氏鏡。

試樣的重要狀態(tài)可以影響的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，因?yàn)?，例如，將死的?xì)胞具有不同的形狀，大小和離子的環(huán)境中不是活的。 自發(fā)熒光是指內(nèi)源性熒光化合物的存在。 這些分子的效率可與pH值，離子濃度和代謝狀態(tài)而有所不同。 額外的自發(fā)熒光可以通過(guò)固定不當(dāng)使用戊二醛特別是當(dāng)生產(chǎn)。

目標(biāo)和重點(diǎn)的平面之間折光結(jié)構(gòu)或細(xì)胞器，例如，脂質(zhì)球形球，可能會(huì)重新聚焦光束到一個(gè)完全未知的位置。 更小的特征可以具有較小的影響，但該光散射出來(lái)的光束的任何折射的功能將降低檢測(cè)信號(hào)的激發(fā)點(diǎn)，因而強(qiáng)度。 它們的累積效應(yīng)也加起來(lái)具有折射率比水高得多的細(xì)胞。

存在或不存在高度染色的結(jié)構(gòu)的上方或下方的聚焦平面指的是z軸分辨率是有限的。 大型結(jié)構(gòu)還可以吸收大量的令人興奮的光，如果高度染色。

穿過(guò)針孔 （圖1（e）），該信號(hào)正比于針孔的直徑的平方（或它的大小 ），它通常被設(shè)置為等于艾里斑處的平面內(nèi)的直徑針孔。 對(duì)齊是很重要的，并且被聚焦到試樣，然后通過(guò)光學(xué)系統(tǒng)重新聚焦回到激光器的圖像應(yīng)該與針孔的中心重合。

檢測(cè)器 （圖1（F））通常為光電倍增管（PMT）。 檢測(cè)到的信號(hào)是成正比的量子效率 。在大多數(shù)共聚焦儀器中使用的光電倍增管的有效量子效率從約15％下降到在藍(lán)端在光譜的紅色端約4％。 至于響應(yīng)時(shí)間 ：大多數(shù)的熒光信號(hào)，能夠迅速被放大，但探測(cè)器他人，如跨膜電流，響應(yīng)速度很慢，使得慢掃描速度必要的。

光電倍增管的電壓決定了光電倍增管的放大。 50伏的增加對(duì)應(yīng)于約2更在增益因子。 要注意的是光電倍增管的黑電平或（亮度）控制允許任意數(shù)量的加法或減法從提出到數(shù)字化的信號(hào)。 黑電平應(yīng)該被設(shè)置成使得在圖像的*暗部分的信號(hào)電平是5-10的數(shù)字單元。

有噪聲的許多可能的來(lái)源，都將扭曲的入賬價(jià)值。 通常情況下，光電倍增管產(chǎn)生的暗電流噪聲相比，信號(hào)電平是很小的。 然而，這是被允許變熱或查看很差染色標(biāo)本時(shí)紅敏光電倍增管不假。 除了從任何雜散光，可能無(wú)意中到達(dá)光電倍增管，主要剩余噪聲源是泊松或統(tǒng)計(jì)噪聲。 這等于記錄在一個(gè)給定像素的光子數(shù)的平方根。 其結(jié)果是它變得更大以較高信號(hào)電平，即使信號(hào)與噪聲的比率提高。

數(shù)字化 ，通常使用的計(jì)算機(jī)（圖1（克））應(yīng)該是線性的。 提交的“8位”顯微鏡的數(shù)字化裝置的電子信號(hào)必須是大小介于1和255之間要被記錄的。 由于統(tǒng)計(jì)噪聲，介于10和220的值是更安全的。 數(shù)字轉(zhuǎn)換系數(shù)是指檢測(cè)并存儲(chǔ)該數(shù)的光子數(shù)之間的比率。 這依賴于光電倍增管的電壓和其它電子增益，但通常為約30，用于記錄在8位儀器正常標(biāo)本。

記住，要衡量這些因素精確，必須持有其他38不變。 祝你好運(yùn)！