徠卡顯微鏡：打開(kāi)光門改進(jìn)熒光共聚焦和STED超分辨率
真正的共聚焦顯微鏡照明系統(tǒng)提供單點(diǎn)，單點(diǎn)檢 測(cè)。該方法被稱為“光學(xué)切片”，因?yàn)樯傻膱D像只包含信息的焦平面。串行檢測(cè)提供高效，低噪音的傳感器信號(hào)轉(zhuǎn)換。雖然非平行檢測(cè)不利于高速成像，現(xiàn)代掃描的概念允許的幀速率每秒400幀在合理的噪聲水平之上。這是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的大多數(shù)應(yīng)用，包括物質(zhì)生活的快速離子輸送現(xiàn)象的監(jiān)測(cè)。
光電子倍增管（PMT）
到今天為止，*常用的傳感器，激光共聚焦顯微鏡的光電子倍增管（PMT），提供低噪音電子信號(hào)，在大范圍的照明強(qiáng)度。光電倍增管的主要缺點(diǎn)是相對(duì)較低的量子效率?30％ - 在*好的情況下，經(jīng)典的光陰和為砷化鎵分層光陰不*過(guò)45％。由于后者引入非常高的不穩(wěn)定性，使這些設(shè)備容易受到損壞，有嚴(yán)重的缺點(diǎn)，因?yàn)檫@些設(shè)備的成本高。
如果光子被吸收通過(guò)光電陰極，如果光子的能量足夠的游離的電子從陰極材料，該電子加速電勢(shì)向正電極。在光電倍增管中，在正電極的順序排列的一系列的倍增電極。在每個(gè)步驟中的典型的電勢(shì)差是100伏。*后在陽(yáng)極收集的電信號(hào)。加速電子入射時(shí)，倍增極發(fā)行的電子數(shù)，即，乘以吸收電子。的乘法因子依賴于倍增極之間的電位差。（陰極與陽(yáng)極）的總電壓是可調(diào)的*多約。1000伏。倍增電極的數(shù)目通常是6 ... 12，電壓倍增電極的數(shù)目除以。
在陽(yáng)極收集和集成的模擬信號(hào)的另一種測(cè)量模式是光子計(jì)數(shù)。這里，由一個(gè)比較器電路的信號(hào)進(jìn)行分析。較單一的二次電子引起的單個(gè)光子的峰值識(shí)別和計(jì)數(shù)。，雖然光電倍增管的*個(gè)裝置，讓光子計(jì)數(shù)，他們?nèi)狈Ω哳l特性，這意味著它們只適用于光子計(jì)數(shù)非常低光水平（單位時(shí)間內(nèi)的光子很少）。
圖 1：左：的PMT的示意圖。與光子的相互作用時(shí)，被釋放的光電子從陰極和中等電壓的第1倍增電極加速。這里有幾個(gè)次級(jí)電子被釋放并加速到下一個(gè)倍增電極。*后，該信號(hào)被收集在陽(yáng)極上。右：示意圖的路政署TM。與光子的相互作用時(shí)，被釋放的光電子從陰極和高電壓的半導(dǎo)體靶加速。這里的動(dòng)能被耗散在一次，此外，電荷被放大的倍增層（雪崩效應(yīng)）。*后，該信號(hào)被從陽(yáng)極收集。混合探測(cè)器（路政署?）
傳感器技術(shù)的*新發(fā)展提出的嵌合體真空技術(shù)（如光電倍增管）和硅技術(shù)（如雪崩光電二極管，雪崩光電二極管）。這些雜交在激光共聚焦顯微鏡徠卡顯微系統(tǒng)，將它們命名為“路政署”（pron.：highdees）。路政署傳感器配有一個(gè)砷化鎵光電陰極，但只使用一個(gè)加速度的步驟，而不是一個(gè)序列的倍增電極。所施加的電壓是約。8000伏。這種設(shè)計(jì)減少了傳感器的脆弱性和損壞的風(fēng)險(xiǎn)減少一些數(shù)量級(jí) - 雖然量子效率高達(dá)45％。
被加速的電子的動(dòng)能完全被消耗硅靶上，并立即給出了一個(gè)約。1500倍放大。與經(jīng)典的倍增電極，*好允許的3?5倍的擴(kuò)增（和需要被測(cè)序出于這個(gè)原因），這是不可能的。乘法層，它轉(zhuǎn)換成一個(gè)雪崩二極管，硅組件終于無(wú)需外部（噪聲）放大電路放大信號(hào)，可測(cè)量的強(qiáng)度。
LightGate
其中的諸多優(yōu)點(diǎn)的的路政署傳感器是高截止頻率，這使得路政署在光子計(jì)數(shù)模式操作，即使在相對(duì)較高的強(qiáng)度水平 - 無(wú)論如何是典型的在生物醫(yī)學(xué)研究和常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)熒光燈樣品的強(qiáng)度。這一事實(shí)打開(kāi)門控模塊，用于將檢測(cè)信號(hào)。
為了獲得從門檢測(cè)，照明光源有脈沖。這是一個(gè)固有功能的白光激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)推出徠卡顯微系統(tǒng)于2007年由（WLL） 。此源設(shè)有八個(gè)獨(dú)立排放bandlets的，這兩種顏色（目前為470 ... 670納米）和強(qiáng)度都獨(dú)立可調(diào)。源脈沖頻率為80 MHz -這是一個(gè)良好的開(kāi)端激發(fā)可調(diào)FLIM測(cè)量以及。
圖 2：影響抑制反射光門。左邊的圖像顯示一個(gè)配置文件（XZ）熒光標(biāo)記的細(xì)胞部分。收集的光在發(fā)射帶和激發(fā)帶。滑動(dòng)面的反射和蓋玻片是顯而易見(jiàn)（**的水平線）。右圖：不改變發(fā)射帶，光閘完全抑制這些反射。
選通所述檢測(cè)信號(hào)允許信號(hào)采集期間，僅在激勵(lì)脈沖之間的熒光發(fā)射時(shí)間。不包括脈沖，由激發(fā)光產(chǎn)生的背景被有效地抑制，并且獨(dú)立于任何分束或阻擋過(guò)濾。這LightGate是一種新的建筑塊在“白焦”的概念，指的是完全可調(diào)，無(wú)濾波器的頻譜光學(xué)切片設(shè)備。
圖 4：甜甜圈型的的STED強(qiáng)度導(dǎo)致排放終身依賴。的中心（STED強(qiáng)度為零）表示*大生存期，從而降低與離中心的距離。*終的壽命不再相關(guān)，作為激發(fā)是零，由于衍射極限的激勵(lì)模式。
封閉式*分辨率STED
第二個(gè)領(lǐng)域HyDs實(shí)益門控模式實(shí)現(xiàn)STED*高分辨率成像。受激發(fā)射損耗的基礎(chǔ)上受衍射限制的斑點(diǎn)與熒光團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)，同時(shí)照明的環(huán)狀區(qū)域的波長(zhǎng)，導(dǎo)致去勵(lì)磁（受激輻射）的照明。這樣的安排，使得只有一個(gè)子衍射區(qū)域處于興奮狀態(tài)，因此允許更高的分辨率比衍射極限的探測(cè)。
在本質(zhì)上，兩個(gè)光質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)的激發(fā)和去激發(fā)。如果有沒(méi)有激勵(lì)光，在激發(fā)圓的疊加和受激發(fā)射損耗環(huán)的中心，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光特征熒光壽命τ后，單純依賴的熒光量子特性的影響和環(huán)境的影響。中心外的第二條路徑的激發(fā)態(tài)返回：受激發(fā)射。因此，特性的壽命縮短。縮短取決于受激發(fā)射損耗的強(qiáng)度，因此增加，直到達(dá)到*大強(qiáng)度，但是這是已經(jīng)在激發(fā)區(qū)域的邊緣）的距離從中心（。
其結(jié)果，特性的熒光壽命是半徑依賴性中的受激發(fā)射損耗集中在中心的*長(zhǎng)的壽命。通過(guò)刪除早期的光子，這*有可能從外部中心發(fā)射，觀察面積進(jìn)一步減小-這是與更高的分辨率相同。
圖 5：門控STED（從左至右）的影響。76 nm的間隔熒光DNA折紙不能分開(kāi)用標(biāo)準(zhǔn)的共聚焦成像。在CW STED，分辨率足以分開(kāi)76納米。當(dāng)收集的排放量只有0.5納米激勵(lì)脈沖后的分離進(jìn)一步提高（提高分辨率）。后來(lái)的集合，這里從3.0納米，單產(chǎn)額外的分辨率提高。
圖 6：雙色共聚焦和雙彩色STED形象：綠色，組蛋白3紅，微管。雙方可視做Chromeo 505和BD地平線的V500，分別在HeLa細(xì)胞。