所提供的寬視場(chǎng)的多個(gè)成像模式中，激光點(diǎn)掃描共聚焦，多光子熒光顯微鏡允許非侵入性的，固定和活細(xì)胞和組織中有高水平的特異性生化時(shí)間分辨成像。盡管傳統(tǒng)的熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)在超微結(jié)構(gòu)的調(diào)查，由于光的衍射，可以與標(biāo)準(zhǔn)的目標(biāo)捕獲的信息量限制設(shè)置的分辨率極限的阻礙。在過(guò)去的幾年中，已經(jīng)采用了一些新穎的儀器為基礎(chǔ)的方法來(lái)規(guī)避衍射極限，包括近場(chǎng)掃描光學(xué)顯微鏡（NSOM），受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡，飽和結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（SSIM）和地面狀態(tài)枯竭（GSD）。這些技術(shù)都實(shí)現(xiàn)了改進(jìn)的橫向（x - y）分辨率下降到幾十納米，更不是一個(gè)數(shù)量級(jí)的下方施加衍射極限的，但每種方法都有一套獨(dú)特的局限性。

有限的空間出現(xiàn)在光學(xué)顯微鏡的分辨率極限從什么一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)被認(rèn)為是一個(gè)基本的物理規(guī)律的光聚焦到一個(gè)離散點(diǎn)在圖像平面固定。恩斯特·阿貝在1873年首先描述，在顯微鏡的最終解決方案是不受制于儀器的光學(xué)質(zhì)量，而是由光的波長(zhǎng)用于收集圖像和孔徑角光學(xué)系統(tǒng)。在正式的書(shū)寫(xiě)方式，側(cè)向和軸向分辨率限制的數(shù)學(xué)描述由下面的公式： 

其中，λ是照明的透射光或熒光的激發(fā)波長(zhǎng)頻帶的平均波長(zhǎng)。的物鏡的數(shù)值孔徑（NA = n?sin(θ)）由成像介質(zhì)的折射率（N，通常是空氣，水，甘油，或油）的孔徑角的正弦值乘以（sin(θ)被定義）。根據(jù)阿貝的理論，圖象由從數(shù)組中的衍射限制的點(diǎn)，具有不同強(qiáng)度的重疊，以產(chǎn)生最終的結(jié)果。因此，優(yōu)化的空間分辨率和圖像的對(duì)比度的唯一機(jī)制是通過(guò)減少成像波長(zhǎng)，增大數(shù)值孔徑，或使用具有較大的折射率的成像介質(zhì)的衍射限制的點(diǎn)的大小最小化。然而，在理想的條件下，橫向分辨率仍然有限接近200至250毫微米（見(jiàn)公式（1） ）的 相對(duì)適度的水平，而軸向分辨率則更差（公式（2） ），500 納米的順序。當(dāng)試圖高度曲折的圖像的功能，如細(xì) 胞器，衍射限制的分辨率表現(xiàn)為不良軸向切片能力，并降低對(duì)比度在成像平面上。此外，整體實(shí)現(xiàn)三維標(biāo)本的標(biāo)本的對(duì)比相對(duì)較差的軸向分辨率一般是占主導(dǎo)地位的。

已被廣泛使用激光掃描共聚焦和多光子顯微鏡適度提高沿橫向和軸向的軸的空間分辨率，但這些技術(shù)仍然有限的方面實(shí)現(xiàn)顯著改善。加上針孔限制在共聚焦顯微鏡檢測(cè)的聚焦激光激發(fā)，在原則上，由1.4倍提高空間分辨率，雖然這只有在信號(hào)與噪聲在一個(gè)顯著的成本實(shí)現(xiàn)。同樣地，多光子熒光顯微鏡利用非線性吸收過(guò)程，以減少有效的激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的大小。但是，再次，更小和更精細(xì)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)被抵消的必要性，使用較長(zhǎng)波長(zhǎng)的激勵(lì)光。作為一個(gè)結(jié)果，而不是提供顯著改善的分辨率，共聚焦和多光子顯微鏡比傳統(tǒng)的廣角技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是減少排放源的焦平面（焦亮），使去除背景信號(hào)源自三維容積重建成像方式獲得清晰的光學(xué)部分。

雖然近場(chǎng)掃描技術(shù)（例如近場(chǎng)光學(xué)顯微鏡），可以達(dá)到很高的分辨率的衍射極限的光學(xué)系統(tǒng)使用的情況下，它們是難以操作的，非侵入性的模式，必須緊跟在試樣表面的地形輪廓，并沒(méi)有多大用處胞漿內(nèi)固定或活細(xì)胞成像深。被稱為受激發(fā)射損耗，GSD和SSIM 合奏聚焦光成像技術(shù)，并基于對(duì)非線性光學(xué)效果，通常需要專門的調(diào)制濾波器的應(yīng)用程序的多個(gè)高強(qiáng)度的脈沖激光激發(fā)光束的幾何形狀控制（一種技術(shù)通常被稱為點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程）。已解決成本過(guò)高的脈沖激光器CW-STED系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)成本較低的連續(xù)波激光器引進(jìn)。即使能夠?qū)崿F(xiàn)橫向分辨率在幾十納米測(cè)量點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的修改方案是，這些方法可能會(huì)損壞標(biāo)本激發(fā)光水平高，要求耐漂白的熒光探針。此外，他們依賴于高度復(fù)雜和專門的顯微鏡配置的平均細(xì)胞生物學(xué)家難以組裝。

單分子成像

全內(nèi)反射熒光（TIRF）顯微鏡檢查居住在幾百納米的蓋玻片平面的熒光探針作為一種可行的技術(shù)的出現(xiàn)，本方法所提供的單分子檢測(cè)能力提供了新的可能性，獲得子衍射分辨率成像?？梢允占銐驍?shù)量的光子，單發(fā)射器的位置可以被確定為幾乎任意精度高?；谶@個(gè)原則，一個(gè)TIRF相關(guān)的技術(shù)稱為熒光成像與納米精度（FIONA）是第一顯示本地化的熒光探針具有精度高，準(zhǔn)確地確定其衍射極限點(diǎn)的中心位置的方法之一擴(kuò)散函數(shù)。不幸的是，定位精度FIONA不直接轉(zhuǎn)化為超分辨率成像由于這樣的事實(shí)，在靠近的多個(gè)發(fā)射器（將被發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記的細(xì)胞器或膜）仍然是困難的，如果不是不可能的，要解決的。

一些其他單分子成像技術(shù)已聘請(qǐng)獨(dú)立的發(fā)射器本地化具有精度高。通過(guò)施加光，有選擇地去除單個(gè)分子一個(gè)FIONA相關(guān)的稱為本地化納米的多個(gè)單分子熒光顯微鏡（NALMS）被證實(shí)為解決受衍射限制的區(qū)域內(nèi)重疊的相同的熒光探針之間的距離的技術(shù)。同樣地，類似的技術(shù)相關(guān)的FIONA稱為單分子漂白與高分辨率成像（SHRIMP）利用光漂白緊密間隔的熒光基團(tuán)中的兩個(gè)或更多個(gè)順序地從已漂白的最后一個(gè)發(fā)射器來(lái)確定自己的位置。單分子高分辨率共存（鴻業(yè)）推出的兩色版本FIONA使用兩個(gè)檢測(cè)通道之間的受托標(biāo)記監(jiān)察注冊(cè)。另一項(xiàng)相關(guān)調(diào)查監(jiān)測(cè)擴(kuò)散到一個(gè)固定的生物目標(biāo)漂白高分辨率成像的熒光探針的結(jié)合，被稱為納米地形（油漆）的成像點(diǎn)積累。不像蝦，NALMS，鴻業(yè)涂料不僅限于發(fā)射器，就可以解決，隨后將討論與超分辨技術(shù)，更緊密的分子密度。其他相關(guān)方法涉及利用量子點(diǎn)的基礎(chǔ)上隨機(jī)的和可逆的進(jìn)入黑暗狀態(tài)，熒光團(tuán)的本地化實(shí)驗(yàn)也被分離和本地化基于其光譜的差異。

上述新型的單分子技術(shù)能夠本地化個(gè)別熒光發(fā)射精度高，但他們是唯一有用的探頭時(shí)，都非常好密度介乎10至50每平方微米的分子彼此隔離。的相當(dāng)大的分子間的間距是必要的，以確?？梢跃_地確定每個(gè)熒光團(tuán)的位置不重疊的發(fā)射器的顯著的干擾。此外，單分子的方法，如菲奧娜，NALMS，涂料和蝦都無(wú)法識(shí)別具有不同的分子機(jī)制，使單個(gè)發(fā)射器的順序讀出從定義一個(gè)特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)大合奏。因此，它不是直到重標(biāo)記的試樣施加兩個(gè)不同的熒光發(fā)射狀態(tài)之間的光控或光轉(zhuǎn)化單分子（也稱為基于探測(cè)的）的超分辨顯微鏡成為了現(xiàn)實(shí)。支持基于探測(cè)的超分辨成像技術(shù)發(fā)展的另一個(gè)定義是引進(jìn)微光電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）相機(jī)系統(tǒng)，有精致的單光子探測(cè)靈敏度。

如圖2中所示是一個(gè)設(shè)計(jì)的顯微鏡進(jìn)行單分子的超分辨率圖像的二維和三維的（這將在下文中更詳細(xì)討論）的商業(yè)實(shí)現(xiàn)。該儀器能夠?qū)崿F(xiàn)20和30納米和50和75納米的三維成像之間的軸向（z）的分辨率之間的橫向（，）分辨率。單分子成像的軸向范圍為約500納米，并且通過(guò)掃描樣品載物臺(tái)或目標(biāo)在?方向，可以進(jìn)一步提高。注重漂移校正系統(tǒng)，使研究人員能夠保持正確的焦平面進(jìn)行單分子成像時(shí)，在60倍的目標(biāo)，以100倍的范圍使用水和浸油技術(shù)。此儀器的激光器包括50毫瓦405納米二極管裝置，以及個(gè)人200毫瓦的固態(tài)激光器的光譜線在488，561，647納米的覆蓋范圍通常用于單分子熒光團(tuán)成像。最后，圖像EMCCD相機(jī)連接到顯微鏡控制軟件系統(tǒng)，使用記錄。振動(dòng)隔離表是需要儀器的穩(wěn)定性。

單分子超分辨率成像

浮現(xiàn)在四個(gè)月內(nèi)優(yōu)雅地展示在2006年的順序和隨機(jī)讀出多個(gè)單分子光開(kāi)關(guān)的染料或光學(xué)熒光筆熒光蛋白的熒光標(biāo)記在密度接近普遍采用的標(biāo)本的精確定位技術(shù)獨(dú)立三重奏廣角和共聚焦熒光顯微鏡（高達(dá)100,000分子每平方微米）。這些幾乎相同的單分子超分辨成像技術(shù)被稱為隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM ;見(jiàn)圖1），光敏定位顯微鏡（PALM）和熒光光敏定位顯微鏡（FPALM）。他們依靠在低功率應(yīng)用激活激光發(fā)射開(kāi)關(guān)觸發(fā)，所以任何特定分子具有小概率光敏，但大部分的人口仍然在原來(lái)的（黑暗或本地的）發(fā)射狀態(tài)。雖然作為他們最初發(fā)表的方法之間的主要區(qū)別只是用來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨成像的熒光探針的性質(zhì)，這些技術(shù)幾乎是相同的。事實(shí)上，原困的研究報(bào)告提到使用的熒光蛋白，而前掌論述了應(yīng)用籠合成熒光。

風(fēng)暴背后的基本原則，，PALM，F(xiàn)PALM，以及相關(guān)的方法是，光開(kāi)關(guān)分子的激活狀態(tài)，必須引起足夠的光子發(fā)射連續(xù)使精確定位，然后進(jìn)入一個(gè)黑暗的狀態(tài)，或停用漂白。此外，人口稀少激活的熒光分子，必須相隔的距離超過(guò)阿貝衍射極限（實(shí)際上，大于約250納米），以使并行記錄許多單獨(dú)的發(fā)射器，每個(gè)都具有一組不同的坐標(biāo)系的橫向圖像中平面。如將要詳細(xì)討論的，來(lái)自圖像的區(qū)域陣列檢測(cè)器捕獲的單分子的質(zhì)心，用于確定是根據(jù)發(fā)出的光子的數(shù)量（參見(jiàn)圖3）用精密的分子坐標(biāo)。發(fā)射器的圖像被捕獲使用一個(gè)低功耗的讀出激光（通常是跨越從1到3個(gè)攝像頭幀），直到它們自發(fā)地光漂白劑或重新輸入暗狀態(tài)。對(duì)于多周期重復(fù)這個(gè)過(guò)程，每次產(chǎn)生一個(gè)隨機(jī)活化的熒光基團(tuán)的獨(dú)特的子集，使許多熒光團(tuán)的位置，來(lái)確定和總結(jié)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，重建的圖像。

參與創(chuàng)建風(fēng)暴超分辨圖像的基本步驟，在圖1中使用了一系列的卡通圖畫(huà)。圖1（a）中示出的目標(biāo)結(jié)構(gòu)示出了假設(shè)標(biāo)記的絲狀密集的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)，它可表示與微管蛋白和肌動(dòng)蛋白的單體單元構(gòu)成的細(xì)胞骨架的生物聚合物。在圖1（b）中，一個(gè)稀疏的熒光探針被激活以產(chǎn)生單分子圖像（用橙色圓圈）表示不重疊的。后用數(shù)碼照相機(jī)拍攝的圖像，點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的單個(gè)分子的定位精度高的基礎(chǔ)上的光子輸出前探頭自發(fā)光漂白劑，或者切換到暗狀態(tài)。本地化分子中心的位置用黑色十字架表示。重復(fù)該過(guò)程，在圖1（三）通過(guò)第1（e），直到所有的熒光探針由于光漂白或耗盡，因?yàn)楸尘盁晒庾兊锰?。最終的超分辨率圖像（圖1（g））是通過(guò)繪制熒光探針的測(cè)量位置的構(gòu)造。

在20世紀(jì)30年代，精度高，單個(gè)分子本地化的概念最早是由德國(guó)物理學(xué)家海森堡更正式的幾個(gè)研究小組在上世紀(jì)80年代和20世紀(jì)90年代解決了堅(jiān)實(shí)的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)?；旧?，雖然表現(xiàn)在一個(gè)有限尺寸的點(diǎn)具有受衍射限制的尺寸時(shí)，與基于CCD的攝像頭捕獲的圖像的一個(gè)單一的熒光發(fā)射極，可確定了精度與該分子的確切位置可以明顯較高（在幾納米的范圍內(nèi)），提供足夠的光子被捕獲。這是由于這樣的事實(shí)，每個(gè)捕獲的光子提供了一個(gè)獨(dú)立的位置測(cè)量的，與最終電平的精度，即總的測(cè)量次數(shù)的平方根成正比。用于確定分子定位坐標(biāo)的方法是基于一個(gè)統(tǒng)計(jì)測(cè)量的光子的分布的高斯函數(shù)的曲線擬合算法。該練習(xí)的目的是要確定的光子的分布（μ），并在安裝位置（不確定性，σ）的標(biāo)準(zhǔn)誤差的平均值，根據(jù)公式：

 （3）

其中，s是發(fā)射極近似真正的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的高斯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差， N 是從熒光分子捕獲的光子的數(shù)量，一個(gè)是成像檢測(cè)器的像素尺寸， 和 b 的標(biāo)準(zhǔn)偏差的背景（包括背景熒光結(jié)合探測(cè)器噪聲）。公式的右手側(cè)的平方根符號(hào)下的第一項(xiàng)（3）需要考慮到光子散粒噪聲，而第二項(xiàng)包括有限的像素大小的檢測(cè)器中的效果。過(guò)去長(zhǎng)期因素的影響背景噪音進(jìn)入方程。通過(guò)應(yīng)用這些簡(jiǎn)單的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)定位精度約10納米時(shí)，測(cè)得的熒光團(tuán)的激發(fā)光分布是約1,000光子和背景噪聲相比可以忽略不計(jì)的分子信號(hào)。在后者的情況下，方程（3）可以近似為：

正如所描述的方程（3）和方程（4） ，在獲得所需的精確的分子定位STORM成像，以盡量減少背景噪聲的同時(shí)，最大限度地提高從熒光探針的光子輸出高精度的結(jié)果的最關(guān)鍵的元件。本地化的中心在一個(gè)最好的情況，如果10,000個(gè)光子可聚集在背景上的情況下，前，無(wú)論是光漂白的熒光團(tuán)或關(guān)閉時(shí)，可確定的精確度下降到1至2納米。然而，由于收集光子數(shù)較低，定位精度越來(lái)越少。因此，如果只有400至500的光子的測(cè)量，準(zhǔn)確度下降到約20納米或更壞。背景在暴風(fēng)成像，從天然的或轉(zhuǎn)染試劑誘導(dǎo)的自體熒光，以及從殘留要么沒(méi)有被激活，或者已經(jīng)進(jìn)入了一個(gè)暗狀態(tài)（但不是光漂白）從鄰近探針的熒光產(chǎn)生。因此，STORM成像的熒光探針的選擇應(yīng)顯示高對(duì)比度，被定義為光活化或光轉(zhuǎn)換之前和之后的熒光發(fā)射的比例。圖3中所示的是一個(gè)單獨(dú)的光開(kāi)關(guān)探針的定位精度。在圖3（a）所示的圖像檔案中的Cy3標(biāo)記的Cy5染料對(duì)在一個(gè)單一的周期，而在圖3（c）從多個(gè)激活周期的階段漂移校正后的質(zhì)心位置的分布。插圖（圖3（b））示出的質(zhì)心的位置。

風(fēng)暴的基本概念一個(gè)相當(dāng)大的變化，Palm和FPALM已采用多種激勵(lì)計(jì)劃及合成熒光基團(tuán)和熒光蛋白的誘導(dǎo)暗態(tài)。因此，直接的風(fēng)暴（dSTORM）操作到它的父類似的方式，但代替配對(duì)photoswitchers的（如Cy3和Cy5），該技術(shù)是能夠使用常規(guī)的單機(jī)硫雜羰花青染料（包括Cy5標(biāo)記的Alexa Fluor 647，一些ATTO系列熒光團(tuán)）。引進(jìn)dSTORM是一個(gè)重要的發(fā)展，因?yàn)樗呀?jīng)成為研究的主要驅(qū)動(dòng)力為開(kāi)發(fā)潛在的新合成熒光光開(kāi)關(guān)與一個(gè)單一的激光，可以選擇性地開(kāi)啟或關(guān)閉。同樣，在修改后的技術(shù)稱為PALM獨(dú)立運(yùn)行的采集（PALMIRA），數(shù)碼相機(jī)操作不同步激活激光器或熒光探針的開(kāi)關(guān)周期的高速。PALMIRA需要熒光團(tuán)要么photoconvertable的或可逆的光開(kāi)關(guān)的應(yīng)用（無(wú)論是合成或熒光蛋白），并大大加快了圖像采集速度提高了100倍。

在其他基于探測(cè)的超分辨方法，使用合成熒光最初報(bào)道是一種技術(shù)，單分子返回（GSDIM），經(jīng)營(yíng)成亞三重態(tài)駕駛它通過(guò)填充一種人工合成的熒光暗態(tài)稱為基態(tài)損耗其次是發(fā)射器的圖像記錄，因?yàn)樗麄冸S機(jī)返回到基態(tài)。許多類似的技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，充分利用和相關(guān)現(xiàn)象，包括閃爍顯微鏡和可逆漂白顯微鏡（RPM），兩個(gè)例子，一個(gè)看似層出不窮的技術(shù)變種托管頻譜的新的首字母縮寫(xiě)。這些新方法所提供的最顯著的潛在的是，它們是能夠生成使用標(biāo)準(zhǔn)合成熒光探針，如熒光素，Alexa的熒光染料，ATTO染料，的carbocyanines和相似的染料，無(wú)論是在簡(jiǎn)單的緩沖區(qū)的一個(gè)子集的超分辨率圖像或耦合到氧拾荒者和脂肪硫醇。然而，這是值得注意的，以產(chǎn)生真正的高分辨率圖像，需要具有非常低的平均時(shí)間與關(guān)斷時(shí)間比的熒光基團(tuán)，所以在任何給定的時(shí)間，只有一小部分的分子被激活。更具體地，約10分子可以定位受衍射限制的區(qū)域內(nèi)，如果平均的通斷比等于0.1。根據(jù)奈奎斯特準(zhǔn)則（下面討論），這對(duì)應(yīng)于只有50％以上的衍射極限的空間分辨率的改善。大多數(shù)傳統(tǒng)的熒光團(tuán)不表現(xiàn)出合適的比例，激勵(lì)探針的發(fā)展，更理想的開(kāi)關(guān)性能的研究。

該系列的圖4中偽彩色圖像說(shuō)明哺乳動(dòng)物的成纖維細(xì)胞腎細(xì)胞中的微管網(wǎng)絡(luò)的風(fēng)暴超分辨成像。與多聚甲醛和glutaraldehyle的混合物中的貼壁非洲綠猴腎細(xì)胞被固定，處理前的小鼠原代α -微管蛋白抗體包被，然后用5％正常山羊血清。洗滌后，將樣品與山羊抗小鼠第二抗體，以Cy3和的Alexa Fluor 647（Cy5標(biāo)記的結(jié)構(gòu)類似物，具有相似的光控性能）雙共軛處理。暴風(fēng)影音圖像生成使用綠色激活激光（532納米）和遠(yuǎn)紅外成像激光（657納米）。常規(guī)的寬視場(chǎng)的微管中的單個(gè)單元格的大面積的熒光圖像示于圖4（a）。在圖4（c）相應(yīng)的風(fēng)暴聚集來(lái)自同一地區(qū)的圖像。白盒裝在圖4（a）的區(qū)域放大顯示在圖4（b）在同一地區(qū)，使用圖4（d）中所示的風(fēng)暴解決。注意交織的微管劃定風(fēng)暴圖像的清晰程度。

STORM成像的熒光探針

適合用于成像與暴風(fēng)和相關(guān)的超分辨率方法的熒光探針是那些具有非常高的亮度和對(duì)比度的水平，在光漂白前每分子的光子產(chǎn)生的最大數(shù)目，或返回到一個(gè)黑暗的，非熒光的狀態(tài)。對(duì)于所有的熒光基團(tuán)的摩爾消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率，在理想的情況下應(yīng)該是100,000和0.75?0.90的范圍內(nèi)，分別的值，乘以以達(dá)到最高的定位精度，相對(duì)亮度是由。此外，風(fēng)暴成像的最佳的探頭應(yīng)表現(xiàn)出光譜的公司的活動(dòng)和非活動(dòng)的種類，充分分離，以便穩(wěn)定和熱穩(wěn)定的光線控制的激活率相比，自發(fā)的相互轉(zhuǎn)換率是非常低的。由于可以photoswitched STORM成像中使用的熒光基團(tuán)，許多這樣的事實(shí)，這些探針還應(yīng)該表現(xiàn)出高開(kāi)關(guān)可靠性，低疲勞率，和交換動(dòng)力學(xué)，可容易地控制。因此，在光漂白或光控暗狀態(tài)而言，最好的探針是那些失活可以平衡，以確保在任何特定時(shí)間，只有一小分子中是激活的激活率。

除了高亮度水平和光控穩(wěn)定性的要求，超分辨率探針必須是能夠擬定精度高的亞細(xì)胞目標(biāo)化，他們應(yīng)該具有盡可能低的背景噪聲水平。熒光蛋白，混合動(dòng)力系統(tǒng)相結(jié)合的一種基因編碼的目的肽與一個(gè)單獨(dú)的合成染料膜滲透物的組件，高度特異性的合成熒光團(tuán)（如MitoTrackers LysoTrackers SYTO熒光團(tuán)）是能選擇性地靶向蛋白組裝或細(xì)胞器。相反，大多數(shù)常見(jiàn)的合成染料和量子點(diǎn)首先必須是精確的標(biāo)記的載體靶向分子共軛。原發(fā)性或繼發(fā)性的抗體可用于免疫熒光法來(lái)合成的熒光基團(tuán)和量子點(diǎn)定位到特定的亞細(xì)胞位置，但接近的熒光探針的目標(biāo)是由10至15納米的抗體分子介導(dǎo)的，精確的實(shí)際熒光涉及的單位又是不確定的。然而，免疫是一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)，它的目標(biāo)是內(nèi)源性蛋白，而熒光蛋白融合往往涉及的過(guò)度表達(dá)可能影響細(xì)胞功能的系統(tǒng)。

屬性選擇合成探針STORM成像

（縮寫(xiě)） EX  （nm） EM  （nm） EC  （×10 -3） QY N光子 CY3B 559 570 130.0 0.67 1400 CY3.5 581 596 150.0 0.67 5000 Cy5 649 664 250.0 0.28 4000 CY5.5 675 694 190.0 0.23 6000 CY7 747 767 200.0 0.28 1000 Alexa Fluor 488 495 519 71.0 0.92 1200 Alexa Fluor 568 578 603 91.3 0.69 2800 Alexa Fluor 647 650 665 240.0 0.33 6000 Alexa Fluor 750 749 775 240.0 0.12 450 ATTO 488 501 523 90.0 0.80 1300 ATTO 520 516 538 110.0 0.90 1200 ATTO 565 563 592 120.0 0.90 20000 ATTO 647 645 669 120.0 0.20 1500 ATTO 647N 644 669 150.0 0.65 3000 ATTO 680 680 700 125.0 0.3 1500 ATTO 740 740 764 120.0 0.1 1000 TAMRA 546 575 90.4 0.2 5000 Dyomics 654 654 675 220.0 NA 3600 DyLight 750 752 778 220.0 NA 700 IRDye 800 CW 778 794 240.0 NA 3000 羅丹明B 530 620 105.0 0.65 750 C-羅丹明 545 575 90.0 0.90 1000 C-熒光 494 518 29.0 0.93 1500

表1

表1給出的匯編所選熒光蛋白的性質(zhì)和合成染料的超分辨率顯微鏡。隨著共同的名稱和/或縮寫(xiě)詞的每個(gè)熒光團(tuán)的激發(fā)峰（實(shí)施例）和發(fā)射波長(zhǎng)（EM），摩爾消光系數(shù)（EC），量子產(chǎn)率（QY），相對(duì)亮度，和每分子發(fā)射的光子數(shù)每個(gè)開(kāi)關(guān)周期（N個(gè)光子）上市。C-羅丹明B和C-熒光素指籠衍生物。指定ND表示尚未確定的值。創(chuàng)建此房產(chǎn)已被科學(xué)和商業(yè)文獻(xiàn)資源的目的不是要全面。公布的報(bào)告，由于在某些情況下，廣泛的光譜的激發(fā)和發(fā)射上市的高峰值可能會(huì)有所不同。以實(shí)際的熒光顯微鏡調(diào)查，一個(gè)特定的熒光基團(tuán)的實(shí)驗(yàn)亮度可能會(huì)有所不同（相對(duì)而言），在此表中提供的亮度。在眾多潛在的這些差異的原因，在傳輸或反射率的光學(xué)顯微鏡和相機(jī)的效率依賴于波長(zhǎng)的變化。

最初是使用一對(duì)的橙色和紅色發(fā)射硫雜羰花青染料Cy3和Cy5，組合以形成被稱為作為花青開(kāi)關(guān)的風(fēng)暴。實(shí)際上，Cy5標(biāo)記可以熒光燈和暗態(tài)之間切換在一個(gè)控制和可逆的方式，使用不同波長(zhǎng)的光（參見(jiàn)圖5）。用紅色激光燈（633，647，或657納米）激發(fā)產(chǎn)生熒光Cy5的PhotoSwitch的染料也可以回到一個(gè)穩(wěn)定的黑暗狀態(tài)。暴露在綠色激光燈（約532納米）將轉(zhuǎn)換Cy5的從黑暗狀態(tài)的熒光狀態(tài)，但恢復(fù)的速度取決于第二激活染料，CY3接近。CY3-Cy5的菁開(kāi)關(guān)疲勞率是優(yōu)秀的，因?yàn)镃y5 的永久漂白發(fā)生之前，可以開(kāi)啟和關(guān)閉數(shù)百次photoswitched。這種染料對(duì)標(biāo)記具有多個(gè)分隔的開(kāi)關(guān)由一個(gè)明確定義的數(shù)目的堿基對(duì)的短的雙鏈DNA分子，和風(fēng)暴用于解決具有高的精確度之間的距離，相鄰的花青開(kāi)關(guān)。

STORM成像，也可用于各種其他光開(kāi)關(guān)的合成探針。在其最簡(jiǎn)單的形式中，使用一個(gè)單一的熒光染料的光譜線的連續(xù)波激光器的工作緊密地重疊的染料的激發(fā)光譜時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)風(fēng)暴。的Alexa Fluor 647因此可以用657納米的激光，完成所有三項(xiàng)任務(wù)所需的風(fēng)暴，包括從探頭的激發(fā)熒光成像，，驅(qū)動(dòng)探頭進(jìn)入一個(gè)黑暗的狀態(tài)，并重新再次回來(lái)熒光狀態(tài)。的熒光花費(fèi)其在熒光狀態(tài)，當(dāng)系統(tǒng)達(dá)到平衡的時(shí)間大約為0.1至0.3％，使約6,000個(gè)光子被檢測(cè)每個(gè)開(kāi)關(guān)周期。高光子通量和低活化平衡的結(jié)合提供了一個(gè)顯著的提升圖像分辨率明顯提高，這是比傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)熒光圖像。此技術(shù)非常適合于成像微管，肌動(dòng)蛋白絲和中間細(xì)胞骨架細(xì)絲直徑阿貝衍射極限遠(yuǎn)低于。

圖5中所示的光控特性和分子結(jié)構(gòu)的硫雜羰花青STORM成像利用活化劑，報(bào)告染料對(duì)。光譜上不同的組合，這些熒光團(tuán)具有光控的行為，如在圖5中所示的（a）所示，在下部面板突出的熒光實(shí)時(shí)痕跡三個(gè)光開(kāi)關(guān)記者：Cy5的（黃線），Cy5.5標(biāo)記（橙色線），和Cy7（紅色線）。每種染料配對(duì)用Cy3標(biāo)記的單元，作為活化劑染料。在圖5（a）的上面板的痕跡用于激活的報(bào)告染料的綠色脈沖激光（532納米）。遠(yuǎn)紅外激光（657納米）連續(xù)照射試樣激發(fā)熒光記者和切換回來(lái)到一個(gè)黑暗的狀態(tài)。合適的分子結(jié)構(gòu)硫雜羰花青記者和活化劑的熒光基團(tuán)（b）至圖5中顯示的相似性，這些探針。

Alexa Fluor 647（圖5）是光開(kāi)關(guān)硫雜羰花青，呫噸類合成的探頭，可以通過(guò)暴露于中等或強(qiáng)激光照明，這取決于實(shí)驗(yàn)參數(shù)的熒光和暗狀態(tài)之間的可逆循環(huán)越來(lái)越多的家庭的成員。許多這些探針已用了數(shù)十年在制備標(biāo)本寬視場(chǎng)和共聚焦熒光顯微鏡，應(yīng)該是同樣有用的超分辨成像。因此，廣泛的熒光團(tuán)，最初認(rèn)為是耐光以來(lái)被證實(shí)進(jìn)入黑暗狀態(tài)，低氧條件下存在脂肪硫醇在溫和的激光功率。其他人可以利用簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)水性的緩沖器或組織文化傳媒具有較高的激光功率成像。表1中所列的幾個(gè)研究得最多的合成染料是有用的風(fēng)暴。這些措施包括ATTO Alexa的熒光染料，染料，carbocyanines，光致變色羅丹明和幾個(gè)籠染料。

熒光蛋白也可以用于單分子的超分辨成像，首先利用公知的變化作為光活化定位顯微鏡。這些獨(dú)特的基因編碼的熒光探針的內(nèi)在能力定義的波長(zhǎng)帶的光曝光時(shí)改變它們的光譜性質(zhì)，并能夠針對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有高的特異性水平。熒光蛋白已被報(bào)道經(jīng)過(guò)多種新穎的光致光控的特性，包括產(chǎn)生不同的發(fā)射和非發(fā)射狀態(tài)，以及上銷的閃爍行為。然而，這些屬性最有用的是光敏，光電轉(zhuǎn)換，光控，這是已統(tǒng)稱為光高亮物業(yè)。因此，光可活化熒光蛋白能夠從一個(gè)黑暗的狀態(tài)被激活，一個(gè)明亮的熒光紫外或紫光照明時(shí)的狀態(tài)，而，可以光學(xué)熒光photoconvertible蛋白轉(zhuǎn)化熒光發(fā)射帶寬從一個(gè)到另一個(gè)。其中最有用的超分辨成像的光活化的熒光蛋白的PA-GFP和PA-mCherry1的（參見(jiàn)圖6）。已證明有效的超分辨技術(shù)的photoconvertible熒光蛋白包括串聯(lián)二聚體Eos的（tdEOS），mEos2，Dronpa，rsCherry（可逆地切換），和青色的光活化的變型中，PS-CFP2。

潛在的最有用的一類光學(xué)熒光筆熒光蛋白包括那些能夠光控間明亮的熒光和暗的狀態(tài)，如Dronpa和rsCherry的。不幸的是，這些變種已經(jīng)不是特別有用，在單分子超分辨調(diào)查，由于低光子輸出在明亮的狀態(tài)。改進(jìn)的光開(kāi)關(guān)的熒光蛋白變種出現(xiàn)時(shí)超分辨成像的候選人，因此，這將是有益的。熒光蛋白的亮度問(wèn)題，仍然是一個(gè)問(wèn)題，當(dāng)這些探頭相比，一般具有顯著較高的光子輸出每個(gè)分子的合成染料。例如，tdEos的相反，在超過(guò)6000的光子通常觀察到的光開(kāi)關(guān)的熒光Cy5標(biāo)記的每個(gè)分子中產(chǎn)生大約500個(gè)光子。另外，硫雜羰花青染料，可以進(jìn)行漂白，而不是使用熒光蛋白的數(shù)量非常有限，當(dāng)之前的數(shù)十至數(shù)百個(gè)開(kāi)關(guān)周期。除了從亮度的問(wèn)題，新熒光蛋白候選人必須被監(jiān)控生色團(tuán)的成熟率和單體的性格與宿主蛋白，以避免緩慢的發(fā)展和聚集文物，分別為目標(biāo)融合時(shí)表示。

量子點(diǎn)是無(wú)機(jī)半導(dǎo)體納米晶體表現(xiàn)出由于密閉激子發(fā)光的熒光性質(zhì)。由于這些熒光基團(tuán)的金屬性質(zhì)的，鈍化層和親水性涂料必須應(yīng)用到量子點(diǎn)作生物應(yīng)用，和定位的，它們必須是綴合到鏈霉抗生物素蛋白，抗體，或一些其他的生物活性序列。在量子點(diǎn)的有利條件是其顯著對(duì)稱的熒光發(fā)射的個(gè)人主頁(yè)上，可以忽略不計(jì)的漂白率，一般高的量子產(chǎn)率。此外，這些探頭具有廣泛的吸收分布，使他們能夠在一個(gè)不同尋常的寬波長(zhǎng)范圍內(nèi)被激發(fā)。不幸的是，卓越的耐光性的量子點(diǎn)，產(chǎn)生了一個(gè)問(wèn)題，為的隨機(jī)超分辨成像，直到量子點(diǎn)可以被轉(zhuǎn)換成一個(gè)光開(kāi)關(guān)的狀態(tài)的情況下，就不會(huì)被解決。此外，針對(duì)量子點(diǎn)，這通常顯示高背景水平和窮得多的合成染料標(biāo)記的同行相比，本地化仍然是一個(gè)問(wèn)題。

一個(gè)大型圖書(shū)館籠合成染料相似的光可活化熒光蛋白（PA-GFP和PA-mCherry1）作為探針隨機(jī)超分辨成像的所有變化，包括風(fēng)暴將特別有用。然而，在目前的時(shí)間，此熒光類別沒(méi)有被廣泛開(kāi)發(fā)和市面上唯一的候選人籠熒光素和羅丹明，這已被證明是有效的單分子超分辨實(shí)驗(yàn)版本。保持器型的合成材料可以使用的紫外線照射，以產(chǎn)生表現(xiàn)出優(yōu)異的對(duì)比度，可以定位精度高，則光漂白的熒光物種的保護(hù)的酯部分脫離。盡管這些探頭，其他合成染料相似，受到普遍缺乏特異性，需要援助的共軛抗體或其他靶向肽，他們持有高光子探頭風(fēng)暴的重大承諾。然而，直到出現(xiàn)較大的品種籠熒光團(tuán)，這個(gè)類將仍然是有限的，對(duì)于許多應(yīng)用。

在選擇超分辨成像探針，研究者面臨著使用合成染料或熒光蛋白的決定。利用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)的缺點(diǎn)是，靶向抗體過(guò)大，無(wú)法滲透膜，因此，唯一有用的靶抗原，除非在固定和透化細(xì)胞的質(zhì)膜的外部區(qū)域上顯示。標(biāo)記抗體的效率也相對(duì)較低，并可能增加10至20納米的本土化標(biāo)簽和目標(biāo)之間的不確定性。與此相反，熒光蛋白通常駐留于5納米的靶向蛋白。的角度，但是，使用的抗體為目標(biāo)合成探針風(fēng)暴和相關(guān)技術(shù)提供了更高的信號(hào)電平比熒光的蛋白質(zhì)，這是更有益的活細(xì)胞成像。應(yīng)當(dāng)指出，高濃度的氧清除劑和脂肪族硫醇，常常有必要與流行的合成染料和單激光器產(chǎn)生光控可以與活細(xì)胞的不兼容。

超分辨率顯微鏡探針發(fā)展的未來(lái)努力將集中在增加的特異性和非常明亮的光開(kāi)關(guān)熒光標(biāo)記效率的同時(shí)，降低靶向部分的大小。夫婦合成熒光基因編碼的目標(biāo)序列設(shè)計(jì)的混合動(dòng)力系統(tǒng)，意味著目前的趨勢(shì)和成功的那一天，這些探頭可能是能夠?qū)崿F(xiàn)這個(gè)目標(biāo)。在這些系統(tǒng)中的最高性能的候選人利用一個(gè)小的肽是在活細(xì)胞中表達(dá)，并能夠招募合成的熒光基團(tuán)，產(chǎn)生有針對(duì)性的熒光。其他方面的發(fā)展圍繞減少通過(guò)尋找更小的基因編碼的獨(dú)立的單位，如植物光素的光，氧，和電壓（LOV）域，其中包含大約一半的水母和珊瑚蛋白質(zhì)的氨基酸的熒光蛋白的大小。然而，無(wú)論在建立新的，更美好的熒光基團(tuán)的進(jìn)度（或缺乏），超分辨率顯微鏡承諾今后許多年里繼續(xù)留在最前沿的光學(xué)顯微鏡。

影響因素STORM成像分辨率

STORM，PALM，F(xiàn)PALM的技術(shù)，如超分辨單分子成像的理論基礎(chǔ)雖然先前已詳細(xì)討論了，在確定任何特別的調(diào)查使用這些方法的實(shí)際結(jié)果的因素有很多。其中的關(guān)鍵方面是必須考慮的是，每個(gè)單獨(dú)的定位測(cè)量的準(zhǔn)確度，已被定位在最終圖像中（通常被稱為分子密度）的探針的密度，和標(biāo)簽本身的物理尺寸。分辨率和單分子定位精度之間的關(guān)系是很容易確定。能力解決兩個(gè)熒光分子作為單獨(dú)的實(shí)體的位置定位的精度，這決定了（不確定性）的每個(gè)分子中，從而對(duì)之間的距離是有限的。反過(guò)來(lái)，定位的精度，主要是依賴于單個(gè)激活，去激活周期期間收集的熒光分子的光子數(shù)，提供了背景噪聲可以忽略不計(jì)。

分子密度和最終圖像的分辨率之間的關(guān)系方面的奈奎斯特采樣理論，這需要約兩個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的每解析單位是最好的描述。在情況下，標(biāo)記效率（有效，則該部分被標(biāo)記的目標(biāo)）的一個(gè)標(biāo)本是不夠的，如精細(xì)結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)不連續(xù)的工件可以出現(xiàn)在超分辨率圖像。因此，對(duì)于一個(gè)二維圖像，具有大小為α的空間特征，所需的最低必要的，以滿足奈奎斯特準(zhǔn)則本地化的熒光探針的分子密度是：

奈奎斯特分子密度≈（2 /α）² （5）

因此，例如，為了實(shí)現(xiàn)20納米的分辨率在兩個(gè)方面，一個(gè)熒光團(tuán)被定位，至少每10納米和一個(gè)非常高的分子密度為每平方微米約10,000個(gè)分子是必需的。20納米級(jí)分辨率的三維超分辨，需要大約一百萬(wàn)的熒光團(tuán)每立方微米。在實(shí)踐中，分子密度低得多的試樣的幾何形狀是考慮到時(shí)，通常就足夠了。生物結(jié)構(gòu)通常是異構(gòu)的，所以，即使與靶標(biāo)位點(diǎn)的相對(duì)高豐度的飽和標(biāo)記可能會(huì)導(dǎo)致一個(gè)相對(duì)較低的總密度。在一般情況下，熒光探針，必須存在足夠的密度，以充分的標(biāo)記結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)映射。由相同的標(biāo)準(zhǔn)，必須有足夠數(shù)量的這些熒光探針在成像過(guò)程中成功地定位。

在單分子中的超分辨技術(shù)，在時(shí)間上分離的熒光發(fā)射通過(guò)采用光開(kāi)關(guān)的熒光基團(tuán)（如PALM和風(fēng)暴），該比率的開(kāi)和關(guān)切換動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)關(guān)鍵的參數(shù)，應(yīng)該進(jìn)行微調(diào)的分子密度。在上述情況下為10,000每平方微米的熒光基團(tuán)的分子密度，為了實(shí)現(xiàn)最終的分辨率為20納米的橫向平面，約600個(gè)熒光團(tuán)必須駐留在側(cè)向投影的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。這種分子密度高，可并發(fā)光開(kāi)關(guān)熒光，多數(shù)不是在他們的黑暗狀態(tài)，導(dǎo)致高背景噪聲的事實(shí)。這些熒光發(fā)出微弱的熒光，或者他們可以自發(fā)地切換到完全沒(méi)有激活照明的熒光狀態(tài)。可以是自發(fā)的或產(chǎn)物可以通過(guò)成像激光誘導(dǎo)的非特異性激活。在分子的密度非常高的情況下，可以產(chǎn)生大量的非特異性激活的熒光基團(tuán)的單分子圖像的重疊，從而損害的能力，以實(shí)現(xiàn)高精度的定位。因此，最好采用光開(kāi)關(guān)的熒光基團(tuán)，表現(xiàn)出低暗態(tài)的排放和低的非特異性激活率。

圖7中給出，是一個(gè)重要的概念，涉及在單分子的超分辨成像的空間分辨率影響最重要的因素之一。與分子密度的分辨率表示在圖7中為一系列在一個(gè)測(cè)試模式中的黃色像素。成像功能，可能會(huì)對(duì)本樣本中的分子密度減?。◤牡撞康巾敳康膱D7），并在逐漸降低的信號(hào)-噪聲比（像素為單位的分?jǐn)?shù)），這些功能變得不可解析，當(dāng)平均分子分離方法的特征尺寸（在圖7中的最上面一行）。因此，等式（5）中所描述的，為了實(shí)現(xiàn)N倍的尺寸D， ND -倍的像素越多，必須獲得較高的分辨率。信號(hào)采集速率（每秒檢測(cè)到的光子）必須增加的一個(gè)因素中的至少ND.這就需要有一個(gè)高ND倍，激發(fā)激光曝光所需的每個(gè)圖像。

在時(shí)間分辨率，基于單分子的超分辨的方法不直接產(chǎn)生一個(gè)圖像，而是用于映射確定從數(shù)千個(gè)別成像幀的特定的分子的本地化。在這種情況下，時(shí)間分辨率確定由數(shù)量的幀所需要的，以獲得合適的圖像的成像。此外，PALM和STORM成像的光開(kāi)關(guān)熒光的性質(zhì)可以產(chǎn)生顳成像速度的約束。熒光蛋白是極好的情況下，需要到一個(gè)特定的細(xì)胞器或生物分子組裝的本地化用作基因編碼的探頭。然而不幸的是，熒光蛋白表現(xiàn)出相對(duì)緩慢的光控動(dòng)力學(xué)相比，許多合成的探針，如Cy5和的Alexa Fluor 647。后者可以表現(xiàn)出高開(kāi)關(guān)速度，使分辨率為約30納米，這是幾個(gè)數(shù)量級(jí)大于所得到的熒光蛋白的1毫秒成像周期。切換周期的速度，幫助確定單分子超分辨率顯微鏡的時(shí)間分辨率將是最終的限制，這種方法適應(yīng)活細(xì)胞成像。

雙色彩風(fēng)暴成像

在熒光顯微術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是容量乘以與一個(gè)以上的熒光基團(tuán)標(biāo)記的圖像樣本來(lái)生成圖像的二，三，四種顏色，幫助解開(kāi)的相對(duì)的組織和不同的生物結(jié)構(gòu)或分子之間發(fā)生的相互作用。在兩個(gè)或兩個(gè)以上的熒光標(biāo)記探針駐留在同一決議體積的情況下，他們可以被視為經(jīng)典的共定位分析算法，以確定發(fā)射光譜之間的重疊程度（因此，體內(nèi)分子間的相互作用產(chǎn)生有關(guān)潛在） 。的能力進(jìn)行調(diào)查，在兩個(gè)或兩個(gè)以上的顏色是必不可少的，用于探測(cè)生物分子之間的相互作用，并提供了寶貴的洞察許多生物過(guò)程的性質(zhì)，如果它可以成功地應(yīng)用到超分辨率成像。

在熒光多色成像的基礎(chǔ)在于找出一些光學(xué)分辨的探針可同時(shí)施加到試樣的要求。風(fēng)暴，原來(lái)的硫雜羰花青染料對(duì)的方法，當(dāng)創(chuàng)建一個(gè)調(diào)色板，每個(gè)光開(kāi)關(guān)的探針組成的組成的記者探頭可以進(jìn)行成像和關(guān)閉，以及活化劑的探針，用于激活記者耦合染料對(duì)通過(guò)吸收特定波長(zhǎng)的光，其吸收光譜的重疊。例如，多達(dá)九個(gè)分辨的探針可形成一個(gè)組合配對(duì)的三個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)（如Cy5標(biāo)記，Cy5.5標(biāo)記，和Cy7）具有不同的發(fā)射波長(zhǎng)和三個(gè)活化劑的熒光基團(tuán)具有不同的吸收光譜（其中包括的Alexa Fluor 405，CY2和Cy3）。利用這一戰(zhàn)略在風(fēng)暴中的第一個(gè)多色成像示威，利用DNA分子固定在表面和雙色免疫熒光標(biāo)記微管蛋白涂層坑標(biāo)本成像。STORM成像能夠?qū)崿F(xiàn)橫向分辨率為約25納米，使用兩個(gè)或三個(gè)不同激活每個(gè)配對(duì)的記者一樣。使用一個(gè)單一的報(bào)告染料的主要優(yōu)點(diǎn)是，因?yàn)楸镜鼗刂嗤墓鈱W(xué)路徑成像的熒光基團(tuán)是來(lái)自于單獨(dú)的通道對(duì)齊。

在圖8中，提出了一系列的拍攝的圖像在寬視場(chǎng)熒光（圖8（a）和圖8（b））和兩色的單分子的超分辨（風(fēng)暴）成像（圖圖8（c））。的檢體是一個(gè)固定的制備粘附非洲綠猴腎細(xì)胞進(jìn)行免疫染色用的染料對(duì)的Alexa Fluor 405和Cy5標(biāo)記線粒體，以及以反白顯示的微管網(wǎng)的Alexa Fluor 488和Cy5。在圖像采集，使用405納米和532納米的激光脈沖交替序列依次激活探頭。激活的探針，然后用657納米激光照射的收集圖像。分子本地化pseudocolored根據(jù)相應(yīng)的激活激光（品紅在405納米和綠色為532納米）。在水介質(zhì)中染色細(xì)胞成像重建從約500,000本地化百分點(diǎn)。白盒中的寬視場(chǎng)圖像（圖8的（a）），相應(yīng)的風(fēng)暴圖像的比較，與圖8中的（三）在圖8（b）對(duì)于已展開(kāi)。請(qǐng)注意風(fēng)暴如何清晰圖像解析即使它們密密麻麻的線粒體和微管相比傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)熒光圖像，可以更精確地確定其空間關(guān)系。

也可以實(shí)現(xiàn)彩色超分辨成像相結(jié)合，合成染料和熒光蛋白標(biāo)簽。例如，使用的組合rsFastLime（綠色熒光蛋白光控來(lái)自Dronpa的）和硫雜羰花青，Cy5標(biāo)記，研究人員能夠通過(guò)順序光控?zé)晒獾鞍子浾吆秃铣扇玖蠘?biāo)記的微管進(jìn)行兩色成像。多色成像單獨(dú)使用熒光蛋白已被證明是更困難的，因?yàn)轭A(yù)活化的熒光蛋白的活化后的狀態(tài)的另一個(gè)重疊的狀態(tài)（由于非常廣泛的吸收和發(fā)射光譜的發(fā)射光譜的這些探頭）。第一個(gè)示范用熒光蛋白質(zhì)與photoconvertable熒光蛋白標(biāo)記，分別在固定的細(xì)胞肌動(dòng)蛋白和粘著復(fù)合tdEos耦合綠色光控Dronpa的的兩色成像。兩個(gè)熒光基團(tuán)依次成像，第一成像由Dronpa其次畢竟的tdEos分子光漂白tdEos。不幸的是，需要消耗一個(gè)探頭成像前，不允許同時(shí)多色成像，從而提出了一種時(shí)間分辨多色成像的障礙。此問(wèn)題被克服由最近開(kāi)發(fā)藍(lán)移Dronpa變型中，稱為BS-Dronpa，和紅色的光活化的熒光蛋白，PA-mCherry1的。配對(duì)bsDronpa Dronpa，或PA-mCherry1的PA-GFP，使兩色同時(shí)成像。然而，仍然需要不斷地開(kāi)發(fā)新的熒光蛋白和合成染料photoswitches的方便快速的多色成像。

三維風(fēng)暴成像

絕大多數(shù)生物結(jié)構(gòu)的三維實(shí)體，從而表現(xiàn)出橫向和軸向尺寸范圍在幾十微米或以上的功能，很容易解決的許多流行的成像方式在熒光顯微鏡。這種能力擴(kuò)展到單分子的超分辨成像，精確地確定一個(gè)機(jī)制來(lái)激活熒光橫向和軸向位置的境界是必要的。不幸的是，熒光團(tuán)的軸向位置上的準(zhǔn)確的信息是很難取得衍射受限的三維成像，因?yàn)榻蛊矫娓浇膮^(qū)域中的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)是對(duì)稱的。的對(duì)稱性，呈現(xiàn)?的確切位置的兩個(gè)分子位于焦平面上方或下方的一對(duì)夫婦的納米之間難以區(qū)分。此外，該點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)也包含在焦平面附近的一個(gè)較大的區(qū)域（高達(dá)幾百納米）使其難以跨越的熒光有關(guān)的軸向位置的信息很少本地化分子居住的任何地方附近的寬視場(chǎng)顯微鏡的焦平面。

幾個(gè)創(chuàng)新的解決方案已經(jīng)被提出用于三維超分辨單分子成像，包括在兩個(gè)不同的焦平面成像，干涉，傾斜的反射鏡，和卷積的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的傅立葉變換的一個(gè)更復(fù)雜的數(shù)學(xué)模型（如雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)），使用空間光調(diào)制器。然而，最簡(jiǎn)單和最直接的技術(shù)之一涉及熒光散光存在于作為?深度的函數(shù)的單分子發(fā)射器的基礎(chǔ)上，確定的軸向位置。最初開(kāi)發(fā)的輔助系統(tǒng)進(jìn)行三維成像風(fēng)暴，由弱柱面透鏡成像光學(xué)列車定位在儀器配置。在操作中，為每個(gè)熒光的圖像的形狀（實(shí)際上，橢圓度）成為一個(gè)高度敏感的方法，它的焦平面的距離（沿z軸的）的圖像的質(zhì)心，而用于本地化的橫向（x ?）的位置。

的三維的風(fēng)暴成像達(dá)到接近50納米600納米的z方向的范圍內(nèi)未經(jīng)掃描的試樣，而執(zhí)行掃描制度允許幾微米深度的標(biāo)本是約25納米的軸向分辨率的同時(shí)橫向分辨率成像。圖9所示的（a）是一個(gè)三維的風(fēng)暴系統(tǒng)的簡(jiǎn)化框圖的光學(xué)列車的原則確定的橢圓率的基礎(chǔ)上，其圖像的熒光探針，通過(guò)引入到成像的柱面透鏡的軸向坐標(biāo)圖路徑。該系列的單分子的光學(xué)圖的右側(cè)的圖像顯示的熒光在各種?位置。在一個(gè)固定的猴腎細(xì)胞中的微管網(wǎng)絡(luò)從一個(gè)三維風(fēng)暴圖像的 x - Y視圖在圖9（b）在軸向位置的信息編碼，根據(jù)圖9（d）圖的彩色欄。在圖9（b）中所示的白盒的放大該x - Y區(qū)域在圖9的（c），與相 應(yīng)的x - ?視圖圖圖9（d）中，以證明可以解決的，單個(gè)微管相當(dāng)很好的軸向尺寸，使用暴風(fēng)影音技術(shù)。

單分子風(fēng)暴型三維成像的另一種方法利用多焦點(diǎn)的平面成像，以實(shí)現(xiàn)軸向分辨率的衍射極限以下。通過(guò)同時(shí)成像在試樣中的兩個(gè)焦平面，激活的熒光團(tuán)（一過(guò)聚焦和underfocused的）的圖像可以被分析，以適應(yīng)一個(gè)三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，以確定它們的空間坐標(biāo)。光斑尺寸之比的軸向位置的單調(diào)函數(shù)，因此，可以定量評(píng)估。稱為雙平面軸向定位顯微鏡，這種技術(shù)是通過(guò)約800納米，在z方向的成像能夠不借助軸向掃描技術(shù)掃描和幾微米之間。雙平面成像的主要好處之一是，橫向分辨率的圖像的軸向位置無(wú)關(guān)。作為該方法的測(cè)試，證明的軸向尺寸，分辨率為75納米的三維成像的熒光涂層的有孔玻璃珠，直徑4微米。

使用寬視場(chǎng)顯微鏡與空間光調(diào)制器，以產(chǎn)生雙螺旋的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)已被修改時(shí)，就可以實(shí)現(xiàn)使用單分子成像技術(shù)的三維精密定位。該儀器被配置為包括被稱為f的圖像處理部，其目的是產(chǎn)生的雙螺旋的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)卷積的標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（所產(chǎn)生的單分子發(fā)射器）與在檢測(cè)路徑空間光調(diào)制器。此卷積乘以標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡圖像的傅立葉變換的專門的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（這是一個(gè)純相位的功能）中的孔共軛平面。為一個(gè)單一的發(fā)射器所產(chǎn)生的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)包含兩個(gè)主要的裂片，其與發(fā)射器的軸向位置旋轉(zhuǎn)的角度取向。熒光團(tuán)（焦平面的上方或下方）的軸向位置通過(guò)建立的校準(zhǔn)曲線，可確定10至20納米的精度（標(biāo)準(zhǔn)偏差），這對(duì)應(yīng)于25至50納米（即完整的軸向分辨率寬度半最大值; FWHM）。最復(fù)雜的方面的雙螺旋顯微鏡的結(jié)構(gòu)的液晶空間光調(diào)制器，這需要一些相匹配的輔助消色差透鏡。

至目前為止，最高分辨率的示范單分子進(jìn)行三維成像定位顯微鏡結(jié)合使用的干涉。稱為iPALM，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)約10納米的垂直和橫向尺寸20納米的分辨率。純?cè)O(shè)計(jì)的中心上的應(yīng)用程序的干涉測(cè)量的差異在兩個(gè)位置依賴途徑所采取的單光子發(fā)射的試樣后，分光鏡復(fù)合，從而使光子本身可以干擾。其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)iPALM連貫性，儀表校準(zhǔn)和容忍的波動(dòng)性熒光的特殊要求，滿足條件使用一個(gè)專門的多相分光鏡。此外，成像深度（Z）被限制到約200納米。iPALM已被用來(lái)解決的軸向尺寸的膜，粘著斑，微管，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。不幸的是，任何商業(yè)為iPALM實(shí)現(xiàn)儀器的復(fù)雜性隨著嚴(yán)格的校準(zhǔn)程序可能交的限制了它的廣泛應(yīng)用。

活細(xì)胞STORM成像

能力進(jìn)行時(shí)間分辨的圖像序列捕獲的活細(xì)胞和組織的熒光顯微鏡的標(biāo)志成果之一，并可以實(shí)施與幾乎所有的對(duì)比度或光學(xué)切片模式，包括寬視場(chǎng)，激光掃描共聚焦，旋轉(zhuǎn)盤(pán)，總的內(nèi)部反射和多光子顯微鏡。超分辨率顯微鏡將這種能力擴(kuò)展到納米級(jí)的分辨率無(wú)疑將提供令人興奮的新的見(jiàn)解，許多發(fā)生在活細(xì)胞的基本流程和交互。即使單分子和聚焦的光點(diǎn)擴(kuò)散工程超分辨率顯微鏡方法仍處于起步階段，一些突破性的發(fā)展已經(jīng)發(fā)生，顯示未來(lái)時(shí)間的調(diào)查，使用這些方法的承諾。因此，示范視頻率STED活神經(jīng)元與60納米的橫向分辨率成像代表什么樣的未來(lái)可能的一個(gè)極好的例子。

雖然單分子定位的超分辨技術(shù)已普遍認(rèn)為需要太多時(shí)間在圖像采集方面有多大的價(jià)值在活細(xì)胞成像，一些調(diào)查已經(jīng)成功地證明了這種方法收集的時(shí)間數(shù)據(jù)。作為一個(gè)例子，細(xì)胞膜的微觀結(jié)構(gòu)監(jiān)測(cè)通過(guò)跟蹤光活化的GFP（PA-綠色熒光蛋白）融合的血凝素分子具有40納米精度的運(yùn)動(dòng)。此外，在活細(xì)胞中的單粒子跟蹤與納米空間精度已被證明在一些場(chǎng)合，盡管這些研究是有限的跟蹤只有一個(gè)或幾個(gè)分子的同時(shí)，并沒(méi)有用于創(chuàng)建超分辨率圖。然而，使用光學(xué)熒光筆熒光蛋白可以在同一單元中進(jìn)行跟蹤，以獲得高分辨率的信息從粒子徑跡上的相關(guān)的蜂窩結(jié)構(gòu)中的一個(gè)和兩個(gè)色實(shí)驗(yàn)大量的蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)。

粘著斑復(fù)合物在活細(xì)胞中，用熒光蛋白tdEos photoconvertable超分辨率成像與單分子定位精度進(jìn)行了演示。獲得每25秒和60秒之間的圖像幀速率（遠(yuǎn)遠(yuǎn)慢于許多傳統(tǒng)的熒光成像方式是可能的），設(shè)有一個(gè)約60納米的橫向分辨率的數(shù)字視頻可視化粘著斑逆行運(yùn)輸和伸長(zhǎng)率，并允許不同的形態(tài)觀察。如圖10所示的單分子定位的圖片，粘著蛋白的樁蛋白活的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)的融合到tdEos。白色，黃色，和青色的箭頭突出顯示個(gè)別粘附配合物所觀察到的圖像捕獲的時(shí)間過(guò)程（1105秒）的相互作用和伸長(zhǎng)率。單分子超分辨成像顯示中不可見(jiàn)的廣角熒光，并透露自己的真實(shí)尺寸大得多的內(nèi)部細(xì)節(jié)出現(xiàn)同質(zhì)化的功能，在廣角新生粘連。

活細(xì)胞成像中也得到了證實(shí)使用直接的的風(fēng)暴（dSTORM）的，它依賴于一種自然發(fā)生的含硫醇劑（還原型谷胱甘肽）的存在下，在動(dòng)物細(xì)胞中減少的狀態(tài)，在毫摩爾濃度是本。，因?yàn)閐STORM利用常用的有機(jī)熒光基團(tuán)（如Cy5標(biāo)記的Alexa Fluor 488，ATTO 655）所表現(xiàn)出的的固有光控性能，是不要求精確的共軛的第二熒光激活。因此，dSTORM可以產(chǎn)生衍射極限的下方，使用與選定的合成熒光標(biāo)記活細(xì)胞顯著提高了分辨率的圖像。該技術(shù)也被檢查翻譯用Cy5的Alexa Fluor 647標(biāo)記的微絲在體外吸附在玻璃表面，應(yīng)該很容易轉(zhuǎn)換成應(yīng)用程序與其他常見(jiàn)的生物大分子沿肌球蛋白II網(wǎng)絡(luò)。其中，使用dSTORM在活細(xì)胞中的限制因素是在與合成的熒光基團(tuán)標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)的難度。然而，開(kāi)發(fā)新的細(xì)胞透性的染料耦合混合貼標(biāo)技術(shù)的進(jìn)步，應(yīng)該在未來(lái)的努力，進(jìn)行活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)使用dSTORM富有成效。

結(jié)論

迄今報(bào)告的風(fēng)暴和相關(guān)技術(shù)令人印象深刻的決議并不代表單分子定位顯微鏡的極限。使用這些方法的空間分辨率的精度和密度的分子本地化，（提供儀器完全調(diào)整），殘留的黑暗狀態(tài)的熒光，熒光亮度從黑暗中的熒光自發(fā)活化率主要取決于決定狀態(tài)下，標(biāo)記效率，標(biāo)簽的大小。在有足夠的探測(cè)亮度和分子密度的情況下，預(yù)期的分辨率幾乎可以是任意高。例如，一個(gè)明亮的熒光探針如的Alexa Fluor 647預(yù)計(jì)將產(chǎn)生足夠多的光子，使一個(gè)只有幾納米的定位精度，從而看好真實(shí)的分子級(jí)分辨率。但是，在這一級(jí)，探針的物理尺寸成為一個(gè)關(guān)鍵因素，所以，在理想情況下，將熒光團(tuán)直接結(jié)合的生物分子還。幸運(yùn)的是，一些新近開(kāi)發(fā)的方法，使特定的附件小的有機(jī)熒光細(xì)胞的蛋白質(zhì)通過(guò)基因編碼方法，并提供了一個(gè)的標(biāo)簽策略可能支持分子級(jí)分辨率。

STORM成像，將有一個(gè)直接關(guān)系到成功的活細(xì)胞觀察的另一個(gè)重要方面是數(shù)據(jù)采集速度。由于本征時(shí)間和空間分辨率之間的折衷，超分辨率成像一般是比較緩慢的。更具體地，構(gòu)造風(fēng)暴圖像繪制在許多成像幀的檢體中的寬視場(chǎng)視圖累計(jì)本地化。因此，成像速度在風(fēng)暴需要準(zhǔn)備一個(gè)高分辨率的圖像的幀的數(shù)量是有限的。相比之下，聚焦的光點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的工程技術(shù)，如STED，有限的時(shí)候需要掃描整個(gè)標(biāo)本的一個(gè)小的焦點(diǎn)。因此，單分子技術(shù)有望比STED相關(guān)的方法要快，成像時(shí)，一個(gè)大的標(biāo)本地區(qū)，但慢的時(shí)候成像面積小。目前，風(fēng)暴的最高分辨率圖像采集時(shí)間通常需要幾分鐘。然而，在60至70納米的空間分辨率，時(shí)間分辨的圖像的時(shí)間分辨率在活細(xì)胞中的幾十秒鐘的聚集。應(yīng)該預(yù)期將改善與成像速度更快的相機(jī)，較高的激發(fā)功率，探頭具有更快的光控率。