雙光子激發(fā)顯微鏡（也稱為非線性的，多光子或雙光子激光掃描顯微鏡）是一種替代共聚焦和去卷積顯微鏡三維成像，提供了明顯的優(yōu)勢(shì)。特別是，雙光子激發(fā)成像擅長(zhǎng)的活細(xì)胞，尤其是在完整的組織，如腦切片，胚胎，整個(gè)器官，甚至整個(gè)動(dòng)物。有效靈敏度的熒光顯微鏡，特別是與厚的樣品，通常是有限的焦點(diǎn)外的喇叭形。此限制，大大降低了在共聚焦顯微鏡中，通過(guò)使用共焦針孔拒絕焦點(diǎn)外的背景熒光，并產(chǎn)生薄（小于1微米），unblurred的光學(xué)部分。另外，解卷積顯微鏡采用了常規(guī)的顯微鏡數(shù)字重建的圖像，使用的測(cè)量的光學(xué)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。

本文介紹了多光子激發(fā)的基本物理原理的描述，并討論了其使用激光掃描顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和局限性。為了說(shuō)明這種技術(shù)的實(shí)用程序，并顯示出一定的物理限制，實(shí)際的考慮因素突出。*后，選定的應(yīng)用程序的雙光子激發(fā)顯微鏡進(jìn)行了討論，以說(shuō)明如何此技術(shù)允許實(shí)驗(yàn)，根本不可能被執(zhí)行，否則。

進(jìn)行任何光學(xué)切片實(shí)驗(yàn)之前，應(yīng)認(rèn)真考慮選擇的技術(shù)是*適合提供答案的問(wèn)題正在調(diào)查中。為了在相對(duì)厚的樣品的熒光顯微鏡，雙光子激發(fā)往往以提供*適合的解決方案，但互補(bǔ)的三維熒光顯微鏡的方法具有特別的好處，給他們每個(gè)人的優(yōu)勢(shì)，在某些實(shí)驗(yàn)。

利用激光共聚焦顯微鏡的針孔，以排除從檢測(cè)出的離焦背景熒光。因此，這種技術(shù)允許三維成較厚的組織切片。然而，激發(fā)光產(chǎn)生熒光，從而產(chǎn)生整個(gè)試樣的光漂白和光毒性，即使信號(hào)只從聚焦的平面內(nèi)，收集。這種大的激發(fā)量能引起顯著的漂白和光毒性的問(wèn)題，尤其是在活體標(biāo)本。此外，在共聚焦顯微鏡的穿透深度穿過(guò)波束路徑的，由試樣散射的激發(fā)和發(fā)射光子吸收激發(fā)能量是有限的。

解卷積技術(shù)通常提供*佳解決方案的樣品外的焦點(diǎn)的背景相對(duì)較低的或整體信號(hào)電平低的試樣。因?yàn)榫矸e方法采用傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)顯微鏡進(jìn)行圖像采集，激發(fā)強(qiáng)度一般保持在低水平。因此，反褶積通常是有效的活細(xì)胞成像單層的。重要的是要意識(shí)到，但是，許多所謂的反褶積方法是簡(jiǎn)單的非線性數(shù)據(jù)篩選不產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)。只有真正的約束迭代卷積技術(shù)產(chǎn)生的量化的數(shù)據(jù)，可用于進(jìn)一步的分析。然而，在寬視場(chǎng)熒光顯微鏡進(jìn)行反褶積提供了有限的滲透到厚的樣品，由于增加外的焦點(diǎn)的背景和光散射。此外，由于大量的計(jì)算需求，反褶積的圖像無(wú)法提供即時(shí)反饋，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

雙光子激發(fā)，在本文中進(jìn)一步討論的那樣，提供了三維光學(xué)切片沒(méi)有吸收（這將導(dǎo)致光漂白和光毒性）的焦點(diǎn)的平面的上方和下方。因此，該技術(shù)提供了更高的穿透深度共聚焦顯微鏡相比，可以降低光毒性活標(biāo)本。因此，使用雙光子激發(fā)顯微鏡，優(yōu)先于其他技術(shù)，需要深入滲透到生活的組織或完整的動(dòng)物標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)。然而，由于管的雙光子激發(fā)的光物理是不同于常規(guī)熒光激發(fā)的，有害的影響偶爾觀察物鏡的熒光基團(tuán)，這反過(guò)來(lái)又限制了該方法的適用性的薄樣品的光學(xué)切片的雙光子激發(fā)的。

雙光子激發(fā)的原理

雙光子激發(fā)在量子光學(xué)是一個(gè)比較老的理論概念。這是*次提出由瑪麗亞G?ppert - 梅耶在她的博士論文和實(shí)驗(yàn)觀察到的一些30年后，激光發(fā)明后不久。因此，相當(dāng)理解的理論和實(shí)驗(yàn)研究的背景存在。來(lái)自在一個(gè)單一的量化后的事件的同時(shí)吸收兩個(gè)光子的雙光子激發(fā)的現(xiàn)象。由于光子的能量是它的波長(zhǎng)成反比，必須具有兩個(gè)吸收的光子的波長(zhǎng)大約兩倍所需的單光子激發(fā)。例如，熒光基團(tuán)，通?？梢晕兆贤夤猓úㄩL(zhǎng)約350納米）也可以被激發(fā)的兩個(gè)光子的近紅外光（約700納米波長(zhǎng)），如果兩者在同一時(shí)間到達(dá)的熒光基團(tuán)（見(jiàn)圖1）。在這種情況下，“同時(shí)”是指約10×E（-18）秒的時(shí)間間隔內(nèi)。

因?yàn)槿Q于同時(shí)吸收雙光子激發(fā)，由此產(chǎn)生的熒光與激發(fā)光強(qiáng)度的平方而變化。這種二次激發(fā)和發(fā)射之間的關(guān)系產(chǎn)生用雙光子激發(fā)顯微鏡（在下面更詳細(xì)討論）相關(guān)聯(lián)的許多顯著的優(yōu)點(diǎn)。為了產(chǎn)生顯著的雙光子吸收事件（兩個(gè)光子的熒光團(tuán)與在同一時(shí)間），光子密度必須是約一百萬(wàn)次，需要生成相同數(shù)量的單光子的吸收。其后果是非常高的激光功率需要產(chǎn)生顯著的雙光子激發(fā)熒光。這個(gè)功率電平是很容易實(shí)現(xiàn)對(duì)焦模式鎖定（脈沖）激光器，其中的脈沖峰值期間的功率是高到足以產(chǎn)生顯著的雙光子激發(fā)的平均激光功率，同時(shí)保持相當(dāng)?shù)汀?/span>在這種情況下，將所得的雙光子激發(fā)態(tài)，并且發(fā)射發(fā)生進(jìn)行常規(guī)的熒光實(shí)驗(yàn)時(shí)，所填充的是相同的單重態(tài)。因此，熒光發(fā)射的雙光子激發(fā)后，在正常的單光子激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)射完全一樣。圖1給出了雅布隆斯基示出一個(gè)單一的（紫外線）的光子同時(shí)吸收兩個(gè)近紅外光子（圖1（b））（圖1（a））的吸收，產(chǎn)生相同的激發(fā)態(tài)。

另一個(gè)密切相關(guān)的非線性光學(xué)過(guò)程中，三光子激發(fā)，也可能被證明是有益的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。三光子激發(fā)發(fā)生在大致相同的方式作為雙光子過(guò)程中，除了三光子必須同時(shí)與熒光團(tuán)產(chǎn)生排放。由于吸收熒光的量子力學(xué)性能，所需的三光子激發(fā)的光子密度僅約十倍大于所需的雙光子吸收（而不是另一個(gè)百萬(wàn)倍更大）的密度。三光子激發(fā)，因此，可以考慮一些實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)有吸引力的選擇。紅外線激光（約1050納米的波長(zhǎng)）作為一個(gè)例子，可以制作三光子激發(fā)的紫外線吸收的熒光團(tuán)（350納米），并同時(shí)引起的吸收綠光的熒光基團(tuán)的雙光子激發(fā)（在525納米） 。此外，可以采用三光子激發(fā)有用的成像區(qū)域擴(kuò)展到深紫外光（例如，使用720納米的光來(lái)激發(fā)熒光團(tuán)，通常在240納米的紫外線吸收）。這是一個(gè)有價(jià)值的傳統(tǒng)顯微鏡的能力增強(qiáng)，因?yàn)榈陀诩s300納米的紫外線的波長(zhǎng)是非常有問(wèn)題的常規(guī)光學(xué)顯微鏡。高階非線性效應(yīng)，如四光子的吸收，實(shí)驗(yàn)已證明，雖然這是不可能的，這些現(xiàn)象會(huì)發(fā)現(xiàn)任何立即在生物學(xué)研究中的應(yīng)用。

雙光子激發(fā)激光掃描顯微鏡

相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)，在激光掃描顯微鏡中的雙光子激發(fā)產(chǎn)生的基本的物理原理的吸收依賴于激發(fā)光強(qiáng)度的平方。在實(shí)踐中，所產(chǎn)生的雙光子激發(fā)一個(gè)單一的脈沖激光通過(guò)光學(xué)顯微鏡。由于激光束聚焦，光子變得更擁擠（其空間密度的增加），其中兩個(gè)相互作用的同時(shí)，一個(gè)單一的熒光基團(tuán)的增加的概率。的激光焦點(diǎn)沿光子擁擠到足以產(chǎn)生顯著發(fā)生雙光子激發(fā)的光路中的*位置。圖2示意性地示出顯微鏡的試樣在焦點(diǎn)中的熒光基團(tuán)的含雙光子激發(fā)產(chǎn)生。上述焦點(diǎn)，光子密度不夠高，在同一瞬間通過(guò)一個(gè)單一的熒光基團(tuán)的吸收截面內(nèi)的兩個(gè)光子。然而，在焦點(diǎn)處，光子是如此緊密地間隔開(kāi)，這是未能發(fā)現(xiàn)它們兩者同時(shí)一個(gè)單一的熒光基團(tuán)的吸收橫截面內(nèi)。

在實(shí)踐中，雙光子激發(fā)顯微鏡不僅可能集中光子空間（通過(guò)聚焦光學(xué)顯微鏡），也通過(guò)集中時(shí)間（通過(guò)利用從鎖模激光脈沖）。將合并的效果可以生成必要的雙光子激發(fā)的光子強(qiáng)度，但脈沖的占空比（脈沖之間的時(shí)間除以脈沖的持續(xù)時(shí)間），10×E（-5）平均輸入功率限制到低于10毫瓦，這僅僅是略大于共聚焦顯微鏡中使用的。雖然被認(rèn)為是*短激光脈沖持續(xù)時(shí)間，通常為約100飛秒1皮秒（10×E（-13）到10×E（-12）秒）之間，在約10×E的熒光團(tuán)的吸收事件相比（-18）秒，持續(xù)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。

雙光子激發(fā)的照明焦點(diǎn)狹窄的定位的基礎(chǔ)的技術(shù)的*重要的優(yōu)勢(shì)，激光共聚焦顯微鏡。在共聚焦顯微鏡中，雖然整個(gè)試樣激發(fā)熒光照明的音量，只在焦平面信號(hào)通過(guò)共焦針孔，允許無(wú)背景要收集的數(shù)據(jù)。與此相反，雙光子激發(fā)產(chǎn)生熒光的焦平面上，由于沒(méi)有產(chǎn)生的背景熒光，針孔不是必需的。共聚焦和雙光子激發(fā)顯微鏡激發(fā)區(qū)域的這種戲劇性的差異可以證明，由成像的光漂白型態(tài)的每個(gè)方法。圖3示出在xz重復(fù)掃描，在熒光素染色福爾瓦的膜一個(gè)單一的xy平面（圖像平面）的方向上從所產(chǎn)生的光漂白柄。漂白的激光激發(fā)熒光團(tuán)共聚焦系統(tǒng)的焦平面上（在圖3（a）所示的白色的框）的上方和下方，有助于觀察到這些廣泛的領(lǐng)域。與此相反，只發(fā)生雙光子激發(fā)的焦平面上，和漂白，因此只限于這方面的（圖3（b））。

許多有利影響，導(dǎo)致激發(fā)雙光子顯微鏡技術(shù)的本地化。也許*重要的是，雙光子激發(fā)顯微鏡的三維分辨率是相同的，以實(shí)現(xiàn)在一個(gè)理想的共聚焦顯微鏡。此外，因?yàn)闆](méi)有聚焦在試樣區(qū)域的吸收，更多的激發(fā)光穿過(guò)試樣的焦點(diǎn)平面。其結(jié)果，大大增加了試樣的滲透，一般是大于兩次或三次未能用激光共聚焦顯微鏡。利用雙光子激發(fā)（在圖3中示出）的另一個(gè)好處是光漂白和光損傷的*小化 - 熒光顯微鏡，活細(xì)胞和組織中的兩個(gè)*嚴(yán)重的局限性。雖然通過(guò)與光的相互作用引起的細(xì)胞損傷所知甚少，很顯然，減小光損傷會(huì)導(dǎo)致受調(diào)查的生物標(biāo)本的擴(kuò)展的可行性。從實(shí)際經(jīng)驗(yàn)中的證據(jù)的紅色激發(fā)光本身并不影響細(xì)胞活力，并有可能大部分觀測(cè)到的光損傷伴有雙光子吸收，因此被限制到焦平面。

雙光子激發(fā)顯微鏡不需要針孔取得三維的分辨率，允許靈活地檢測(cè)的幾何形狀。檢測(cè)退掃描和非退雙光子激發(fā)的幾何結(jié)構(gòu)，如圖4所示。在退掃描的幾何形狀，發(fā)出的光（圖中以藍(lán)色）作為激發(fā)光沿著相同的路徑返回，撞擊前掃描鏡通過(guò)共焦針孔的檢測(cè)器（圖4（a））。在共聚焦顯微鏡中，必須利用這種幾何形狀，以消除檢測(cè)聚焦發(fā)射。非退束路徑提供多個(gè)配置的替代品：共軛平面檢測(cè)器的布置定位后，立即的物鏡（圖4（b）條，并反映所發(fā)出的光通過(guò)一傳遞透鏡放置在一個(gè)平面上的共軛到檢測(cè)器的分色鏡客觀的后孔;由一個(gè)外部檢測(cè)器直接從檢體所發(fā)出的光可能會(huì)被收集，而不通過(guò)所述物鏡（圖4（c），或所發(fā)出的光由二向色反射鏡被轉(zhuǎn)移到一個(gè)電荷耦合器件（CCD）相機(jī)在中間像平面中，為了獲得寬視場(chǎng)圖像（圖圖4（d））。這后一種幾何配置適用于快速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)中，采用雙光子激發(fā)。

雖然這是可以用于雙光子激發(fā)，以便充分利用這種技術(shù)的穿透深度，使用退掃描檢測(cè)，建議使用一個(gè)非退的選擇（外部檢測(cè)器）。非退的路徑使收集更多的散射光子，需要較少的光學(xué)元件，例如反射鏡和透鏡，并減少路徑的長(zhǎng)度，沿其在空氣中的灰塵顆粒的熒光信號(hào)干擾。因此，使用非退的檢測(cè)方法，用雙光子激發(fā)的顯著提高收集效率，并且是必不可少的*大深度滲透到活組織。

深切片機(jī)制

如上所述，雙光子激發(fā)顯微鏡***的優(yōu)勢(shì)是它能夠提供**的光學(xué)切片厚的樣品更大的深度比通過(guò)其它方法是可能的。，因此，重要的是要了解通過(guò)何種方式實(shí)現(xiàn)這種穿透深度增加。三個(gè)物理機(jī)制存在功能組合，讓增加的效益，在厚厚的標(biāo)本：

• 無(wú)外的病灶吸收，使更多的激發(fā)光的光子，以達(dá)到所需的檢體的水平。

• 雙光子激發(fā)經(jīng)過(guò)紅光和紅外光散射比少光的藍(lán)顏色（波長(zhǎng)較短）。

• 光散射的影響是不利的雙光子顯微鏡，共聚焦顯微鏡比。

雖然功能組合，它是有用的，單獨(dú)考慮的三種機(jī)制。雙光子顯微鏡允許更大比例的激勵(lì)照明達(dá)到，因?yàn)槲盏臈l件不能滿足以外的區(qū)域的光線集中，并消除吸收聚焦在焦平面。在共聚焦顯微鏡中，激發(fā)光子被吸收的激勵(lì)光路徑的過(guò)程中遇到的任何熒光。其結(jié)果是，較少的光子到達(dá)的焦平面上，從而降低所產(chǎn)生的信號(hào)。如果樣品含有熒光基團(tuán)在整個(gè)在如圖5所示的圖像中，如圖所示，這種效應(yīng)變得更加明顯。若丹明染色的聚合物薄膜樣品，在該圖中，本身就是非散射，但包含均勻分布的熒光團(tuán)濃度高。

在圖5中，在xz掃描的頂部是*靠近物鏡，到試樣（z軸向）為每個(gè)xz掃描的深度的函數(shù)繪制成的熒光強(qiáng)度。對(duì)于單光子激發(fā)機(jī)制（激光共聚焦顯微鏡，圖圖5（a）），強(qiáng)度呈現(xiàn)穩(wěn)步下降，作為激發(fā)光被越來(lái)越多地吸收，因?yàn)樗_(dá)到更深的焦平面的穿透深度。鮮明的對(duì)比，雙光子吸收只發(fā)生在焦平面上，不吸收的激發(fā)光的光路中的物鏡的焦平面之間的熒光團(tuán)。因此，所有的激發(fā)能達(dá)到的焦平面上，保持恒定的試樣的深度（在本例中的聚合物）的熒光信號(hào)。圖5（b）示出的共聚焦和雙光子激發(fā)的顯著區(qū)別，圖中，強(qiáng)度是相對(duì)恒定的穿透深度。

第二個(gè)機(jī)制促進(jìn)雙光子激發(fā)，在較厚的試樣的性能是“更紅”的激發(fā)光在雙光子激發(fā)顯微鏡患有的試樣比“更藍(lán)”中使用的常規(guī)激勵(lì)的激勵(lì)光的散射少。生物組織可以被認(rèn)為是具有可變折射率的非均勻介質(zhì)。通過(guò)這樣的介質(zhì)中傳播的光被乘以在各個(gè)方向散射。在熒光顯微鏡中，激發(fā)光入射在試樣上可以分散到不同程度才達(dá)到的焦平面上，因?yàn)樗祷氐綑z測(cè)器通過(guò)試樣產(chǎn)生的熒光也可以進(jìn)行散射。這些散射效應(yīng)相結(jié)合，以減少收集到的熒光信號(hào)。

由于材料的不規(guī)則分布的生物樣本內(nèi)具有可變的屬性，這是不可能的計(jì)算模型精確的散射行為。然而，*簡(jiǎn)單的近似瑞利散射的餾分，在這種系統(tǒng)中散射的光提供了一個(gè)*小的估計(jì)。在這種情況下，散射光量的第四功率的光的波長(zhǎng)成反比。運(yùn)用這一關(guān)系的估計(jì)，488納米的光（光子）預(yù)計(jì)將進(jìn)行約7倍*過(guò)800納米（雙光子）光散射。因此，這兩種不同的散射附加有助于雙光子激發(fā)的激光，可以達(dá)到的焦平面的量，進(jìn)一步增加了試樣的穿透深度。在實(shí)踐中，所觀察到的散射與組織結(jié)構(gòu)相互作用總是大于由瑞利近似預(yù)測(cè)，但更長(zhǎng)的時(shí)間（更紅）波長(zhǎng)較短（更藍(lán)）波長(zhǎng)小于總是分散的。熒光顯微技術(shù)在檢測(cè)階段中，所發(fā)出的熒光是相同的無(wú)論是否利用單或雙光子激發(fā)，因此產(chǎn)生，熒光發(fā)射的散射會(huì)影響這兩種方法同樣。

上面列出的第三個(gè)因素，是任何激發(fā)或熒光光散射不影響雙光子技術(shù)信號(hào)采集顯著，因?yàn)樗诩す夤簿劢癸@微鏡。這種差異可以通過(guò)考慮在雙光子激發(fā)顯微鏡的圖像形成的物理解釋。聚焦的吸收和散射的差異而缺乏既有助于增加激勵(lì)光到達(dá)焦平面完整的組織深處，這第三個(gè)因素，實(shí)際上產(chǎn)生與雙光子激發(fā)的提高圖像的對(duì)比度。在圖6中示出的物理方面造成這一。

在共聚焦顯微鏡（參考圖6）中，激發(fā)光（藍(lán)色）被聚焦到試樣（一），和從該焦斑的熒光（綠色）被捕獲由物鏡，通過(guò)干凈通過(guò)針孔，并到達(dá)檢測(cè)器的（二）。這種熒光是所需要的信號(hào)，但它的一些可以被分散，因?yàn)樗鼈鬟f通過(guò)試樣（三）。這種散射的熒光不通過(guò)針孔，并因此丟失，未檢測(cè)到。這些損失大大降低所檢測(cè)到的熒光信號(hào)。作為激發(fā)光穿過(guò)試樣，它可能被吸收（d）或散才達(dá)到的焦點(diǎn)（五）。如果它被吸收，它可以產(chǎn)生熒光。由于該熒光從焦點(diǎn)并不會(huì)出現(xiàn)，但不穿過(guò)針孔，所以它不被有效地檢測(cè)。然而，聚焦熒光的一小部分可以被分散到針孔，然后被檢測(cè)。此熒光將創(chuàng)建的背景霧，將大致恒定的圖像，在圖7和圖8中給出的示例中所示。此霧降低了圖像的動(dòng)態(tài)范圍，從而降低了圖像的對(duì)比度。同樣，散射的激發(fā)能產(chǎn)生熒光（五），該熒光也可以向背景灰霧（六）。

（紅色）的激發(fā)光子的雙光子激發(fā)的方法（也參見(jiàn)圖6），可以散（克）在共焦系統(tǒng)中。然而，兩個(gè)光子同時(shí)被散射的相同的試樣的位置的概率基本上是零，因此，背景灰霧困擾厚的樣品在共焦成像中不產(chǎn)生雙光子激發(fā)。此外，更大的激發(fā)光的比例達(dá)到的焦平面（h和i），由于上面所討論的前兩個(gè)因素：降低出的離焦吸收和波長(zhǎng)較長(zhǎng)的雙光子激發(fā)的光的散射減少。重要的是，所產(chǎn)生的熒光（綠色），則即使散射，由光電倍增管（j）條中被檢測(cè)到的可能性增加，因?yàn)闆](méi)有針孔存在來(lái)阻止它（十一）。這不敏感的病灶吸收散射效應(yīng)和缺乏允許相當(dāng)深度內(nèi)標(biāo)本保存完整的圖像對(duì)比度。

在圖7（鯊魚(yú)脈絡(luò)叢用熒光素染色）的圖像提供了共聚焦和雙光子顯微成像質(zhì)量的比較。這些圖像被收集在試樣表面，這是允許從這個(gè)標(biāo)本利用激光共聚焦顯微鏡圖像的對(duì)比度足夠的*大深度在80微米以下。雖然*亮的功能的信號(hào)電平可以很容易地在兩種方法之間匹配的共聚焦圖像（圖7（a））中，整體圖像的對(duì)比度大大降低背景灰霧的存在。雙光子激發(fā)的圖像（圖7（b））相比較而言，顯示出優(yōu)異的強(qiáng)度對(duì)比。由于散射的熒光厚的生物標(biāo)本中是顯著的，使用退掃描檢測(cè)，即使有一個(gè)“開(kāi)放的”針孔，不足以獲得雙光子激發(fā)的優(yōu)點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)的全部潛力，一個(gè)非退檢測(cè)方案（參見(jiàn)圖4），其中的熒光不返回通過(guò)掃描系統(tǒng)，因?yàn)樗仨氃诠簿劢癸@微鏡中，需要增加的熒光收集效率。使用圖7中所示的相同的鯊魚(yú)標(biāo)本，采用退掃描（針孔“開(kāi)放”）和非退掃描檢測(cè)方法在圖8中的圖像的比較。每個(gè)檢測(cè)的幾何形狀，在相同的成像光學(xué)元件的使用，包括二色鏡，屏障過(guò)濾器和光電倍增管檢測(cè)器。*初，將試樣用上面提供了一定強(qiáng)度的對(duì)比度（圖8（a））的*大深度（140微米）附近的退掃描檢測(cè)成像。所有設(shè)置保持固定的，而在圖8（b）中呈現(xiàn)的圖像切換到非退檢測(cè)，收集。很顯然，這種非退圖像完全飽和（*大顯示亮度）在許多領(lǐng)域，展示了改進(jìn)的信號(hào)采集與檢測(cè)的幾何形狀。的激發(fā)條件，因?yàn)樵谶@兩種情況下是相同的，這個(gè)信號(hào)強(qiáng)度增加八倍可以完全歸咎于收集散射的熒光光子，啟用的非退檢測(cè)的幾何形狀。以獲得完整的范圍內(nèi)不飽和的圖像（圖8（c）圖中所示），在光電倍增管的電壓，從1000減少到750伏，這意味著該樣品可以利用的非退檢測(cè)裝置，更深層的掃描。事實(shí)上，在該樣品上可接受的成像穿透深度的組織，但并不限定于由物鏡的工作距離。

圖像分辨率

與雙光子激發(fā)所獲得的圖像分辨率優(yōu)于實(shí)現(xiàn)良好對(duì)準(zhǔn)的共聚焦顯微鏡。較長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)（例如，紅色或紅外線，代替紫外線或藍(lán)色）的利用率，盡管雙光子激發(fā)的一個(gè)有利方面，在一個(gè)較大的分辨光斑的實(shí)際結(jié)果。如果無(wú)法解析的共聚焦顯微鏡中的生物結(jié)構(gòu)，同樣沒(méi)有解決在雙光子激發(fā)激光掃描顯微鏡。雖然這一點(diǎn)是很好的理解經(jīng)歷了這些技術(shù)的顯微鏡，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的潛在用戶通常認(rèn)為雙光子激發(fā)的優(yōu)勢(shì)，包括更高的分辨率。

成像厚標(biāo)本

如前所述，雙光子激發(fā)的更有效的厚的樣品成像，由于三個(gè)因素的綜合效果：聚焦吸收不足使更多的激發(fā)光，以達(dá)到預(yù)期的試樣區(qū)域，紅色的是激發(fā)光散熒光散射的影響較少的危害比共聚焦顯微鏡雙光子顯微鏡。當(dāng)利用長(zhǎng)工作距離的光學(xué)元件和非退檢測(cè)配置，往往是有限的穿透深度和圖像質(zhì)量的能力，有效地標(biāo)記組織。引進(jìn)熒光標(biāo)簽進(jìn)入組織變得越來(lái)越困難，在更深處。利用綠色熒光蛋白（GFP）在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)是在體內(nèi)，有可能提高雙光子激發(fā)成像。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物改進(jìn)技術(shù)，特定器官和對(duì)動(dòng)物蛋白的檢測(cè)采用雙光子激發(fā)熒光標(biāo)記的發(fā)展提供了巨大的承諾。某些組織特征可能施加額外的限制穿透深度成像厚的標(biāo)本，要么大量色素組織的特別關(guān)注，如動(dòng)物肝臟，或高散射組織，如皮膚。

薄的樣品成像

一般情況下，薄的樣品成像并不一定有利于從雙光子激發(fā)比傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡的技術(shù)顯著。這樣做的原因是略有增加光在焦平面（在厚的樣品的總的光漂白大大降低相比，現(xiàn)有技術(shù)中，如在圖3中示出），可能會(huì)發(fā)生的。有應(yīng)用程序，但是，其中的雙光子激發(fā)是有利的，即使是薄的準(zhǔn)備;一個(gè)實(shí)施例中的紫外線激發(fā)熒光團(tuán)，如NADH（下面進(jìn)一步討論）的攝像。在此類實(shí)驗(yàn)中，由紫外線造成的損害更明顯比雙光子誘導(dǎo)漂白。在評(píng)估雙光子激發(fā)的潛在好處，它始終是值得首先開(kāi)展實(shí)驗(yàn)共聚焦顯微鏡。一旦知道期望的成像的共焦所施加的限制，然后很容易地確定是否完成實(shí)驗(yàn)的雙光子激發(fā)的使用將是有利的。

吸收光譜

這是常見(jiàn)的雙光子吸收光譜承擔(dān)相應(yīng)的單光子光譜的相似性很小。到目前為止取得的經(jīng)驗(yàn)表明，大部分的熒光基團(tuán)的功能相當(dāng)好時(shí)，雙光子激發(fā)的照明具有兩倍的波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)的單光子的吸收峰。對(duì)于本文的討論范圍之外的物理-化學(xué)的原因，具有非對(duì)稱的化學(xué)結(jié)構(gòu)的熒光基團(tuán)傾向于堅(jiān)持這種關(guān)系更加緊密地比對(duì)稱的。例如，特征在于，一種非對(duì)稱的熒光基團(tuán)熒光蛋白（CFP，GFP，YFP，和其他），并在兩倍的單光子激發(fā)波長(zhǎng)強(qiáng)烈吸收。然而，對(duì)于雙光子激發(fā)顯微鏡的能力被充分利用，熒光團(tuán)的吸收光譜必須進(jìn)行測(cè)量。這是相當(dāng)多的挑戰(zhàn)技術(shù)上比傳統(tǒng)的單光子吸收光譜測(cè)量，只有少數(shù)的該信息的來(lái)源存在。作為利用顯微技術(shù)增加，它是可能的雙光子吸收光譜將變得更加普遍可用。

本地化的光化學(xué)

雙光子激發(fā)的一個(gè)附加功能是在焦區(qū)的試樣的光化學(xué)反應(yīng)的啟動(dòng)。各種實(shí)驗(yàn)用的化學(xué)過(guò)程，涉及紫外線光致反應(yīng)，可以被取代的雙光子激發(fā)。反應(yīng)的一類，染料的uncaging的，光化學(xué)誘導(dǎo)非熒光分子的熒光，可以啟動(dòng)單個(gè)細(xì)胞中，用雙光子激發(fā)的組織。同樣，生物刺激劑或抑制劑可以由相同的激發(fā)過(guò)程開(kāi)鎖。各種各樣的潛在2光子激發(fā)的uncaging的方法有沒(méi)有得到充分的發(fā)展，主要是由于產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)，其范圍可以從毫秒到幾秒的動(dòng)力學(xué)限制。因此，物鏡化合物可能擴(kuò)散激發(fā)時(shí)間，它成為活躍的時(shí)間之間的試樣內(nèi)的幾微米。盡管這一困難，該技術(shù)在一些有趣的生物學(xué)的應(yīng)用很可能是有價(jià)值的，其中一些是在下面的章節(jié)中討論。

激光光源

用于雙光子激發(fā)顯微鏡的儀器要求幾乎是相同的共聚焦顯微鏡的激光激發(fā)源的異常，這是相當(dāng)大的差別。*快鎖模激光器系統(tǒng)的兩種類型的一般使用與當(dāng)前的雙光子激發(fā)顯微鏡：摻鈦藍(lán)寶石激光的Nd：YLF激光器。雖然這些系統(tǒng)可以從普通的電源插座供電，不需要冷卻水，他們比小型風(fēng)冷激光共聚焦顯微鏡采用相當(dāng)昂貴。在Ti：藍(lán)寶石激光器（700至1100納米）的波長(zhǎng)可調(diào)諧性更大的通用性比單波長(zhǎng)的Nd：YLF激光器（1047納米），和目前的商業(yè)模型，鈦藍(lán)寶石激光器的波長(zhǎng)范圍720至900覆蓋納米通過(guò)方便地實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)控制。激光照排系統(tǒng)的易用性和多功能性的進(jìn)一步改善，在可預(yù)見(jiàn)的未來(lái)很可能繼續(xù)。

激光功率

所需的激光功率，以激發(fā)熒光基團(tuán)的含試樣都有一個(gè)*佳的限制值。隨著激光功率的增加，熒光強(qiáng)度的增加，熒光團(tuán)的飽和度點(diǎn)。飽和度的條件下發(fā)生在足以導(dǎo)致顯著的比例存在的熒光分子的激發(fā)，而不是基態(tài)（此功率級(jí)大約是單光子激發(fā)，在試樣1毫瓦和50毫瓦的激光功率是在雙光子激發(fā)的試樣）。在高功率水平，額外的光子根本無(wú)法激發(fā)更多的熒光分子。任何*出飽和點(diǎn)的激發(fā)能量增加有助于增加的光損傷和光漂白。每個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置必須束掃描過(guò)程中施加的損害進(jìn)行評(píng)估，重要的是要認(rèn)識(shí)到瑣碎的細(xì)胞活力測(cè)試（如酯酶活性或染料排斥）并不總是準(zhǔn)確地反映細(xì)胞光損傷。對(duì)于許多實(shí)驗(yàn)，更嚴(yán)格的功能測(cè)試可以提供更多資料。作為例子，在*近發(fā)表的調(diào)查，確認(rèn)倉(cāng)鼠胚胎的生存能力通過(guò)續(xù)發(fā)展，而在另一種是通過(guò)維持正常的葡萄糖刺激的NAD（P）H的響應(yīng)確認(rèn)胰島的生存能力。

作為雙光子激發(fā)顯微鏡

一些*近發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的例子說(shuō)明常見(jiàn)的情況下，雙光子激發(fā)提供優(yōu)于聚焦成像。雖然在這個(gè)討論中沒(méi)有提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)，雙光子激發(fā)造成的其光毒性降低的好處亮點(diǎn)聚焦，提高組織成像深度，啟動(dòng)本地化的光化學(xué)反應(yīng)的能力。

雙光子激發(fā)顯微鏡一般比激光共聚焦顯微鏡，*近的一項(xiàng)研究證明了利用倉(cāng)鼠胚胎發(fā)育時(shí)間推移成像光毒性。在這個(gè)例子中，胚胎的發(fā)展要監(jiān)視的連續(xù)10個(gè)小時(shí)以上，使用雙光子激發(fā)的一個(gè)重要的線粒體染料。相比較而言，當(dāng)聚焦的方法，正常胚胎發(fā)育停止后，只有幾分鐘的共聚焦激光曝光。研究人員得出的結(jié)論是雙光子激發(fā)激光的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的（1047納米）允許胚胎存活率大大增加了時(shí)間。同樣的調(diào)查還利用雙光子激發(fā)顯微鏡無(wú)機(jī)磷酸鹽倉(cāng)鼠胚胎發(fā)育的影響進(jìn)行評(píng)估。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，生活倉(cāng)鼠胚胎培養(yǎng)在不同量的無(wú)機(jī)磷酸鹽，線粒體分布在6個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)，使用雙光子激發(fā)顯微鏡成像。進(jìn)一步的胚胎發(fā)育，形態(tài)評(píng)估后進(jìn)行27小時(shí)和51小時(shí)的文化。雙光子照明非擾動(dòng)的發(fā)展倉(cāng)鼠胚胎從這些研究提供了明確的證據(jù)，而他們破壞并行共焦成像。

兩個(gè)已發(fā)表的研究利用無(wú)毒的雙光子激發(fā)的性質(zhì)，來(lái)執(zhí)行在人體皮膚的體內(nèi)成像。一項(xiàng)調(diào)查涉及從皮膚采集的自體熒光信號(hào)，在不同深度（0?50和100?150微米），利用激發(fā)波長(zhǎng)范圍從730到960納米的詳細(xì)的光譜。與反射光的共聚焦顯微鏡結(jié)合使用時(shí)，在相結(jié)合的手法從皮膚的相同區(qū)域中，提供詳細(xì)的非破壞性的反射光，皮膚層的自體熒光圖像。

雙光子激發(fā)提供避免紫外線照射的光毒性作用的能力，在該光譜范圍內(nèi)的被激活的熒光物種。此功能特別有益的成像自然產(chǎn)生降低吡啶核苷酸[ NAD（P）H ]作為細(xì)胞呼吸指標(biāo)。由于NAD（P）H具有小的吸收截面，一個(gè)低的量子產(chǎn)率，并吸收在紫外，它是難以激發(fā)和測(cè)量，并有可能造成相當(dāng)大的光損傷。NAD（P）H成像已動(dòng)用部分分化培養(yǎng)L6肌管細(xì)胞的病理生理研究。表現(xiàn)在細(xì)胞NAD（P）H圖像的自體熒光圖案主要反映在線粒體中的NADH圈點(diǎn)地區(qū)彌漫的細(xì)胞質(zhì)信號(hào)。在分化的細(xì)胞中，熒光是線粒體本地化為列肌纖維之間的條痕，和伴隨的熒光增加的葡萄糖濃度的增加，可見(jiàn)一斑。本研究證明了在糖代謝中的均勻性，和葡萄糖利用的動(dòng)力學(xué)可以實(shí)時(shí)定義為一個(gè)單細(xì)胞，或可被平均在幾個(gè)細(xì)胞。

在文獻(xiàn)中已報(bào)道的其他領(lǐng)域，調(diào)查為中心對(duì)個(gè)人的β細(xì)胞的胰島內(nèi)NAD（P）H的定量雙光子成像，這是一種準(zhǔn)球形微約1000個(gè)細(xì)胞組成的器官。雙光子技術(shù)的空間分辨率擴(kuò)大的整體核苷酸成像，允許的細(xì)胞質(zhì)和線粒體NAD（P）H的信號(hào)的分離。圖9給出一個(gè)典型的圖像于一個(gè)完整的胰島β細(xì)胞的NAD（P）H的自體熒光，顯示從細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的信號(hào)，后者是更明亮，有些點(diǎn)狀。單細(xì)胞的輪廓是可見(jiàn)的，如細(xì)胞核，這兩者出現(xiàn)暗。在這些區(qū)域的胰島β細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和線粒體信號(hào)由分離葡萄糖和丙酮酸的代謝詳細(xì)檢查成為可能。

目前的模型對(duì)葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）建議進(jìn)一步沿信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的代謝產(chǎn)物刺激了類似的事件，導(dǎo)致胰島素分泌的信號(hào)級(jí)聯(lián)，雖然的丙酮酸會(huì)加強(qiáng)GSIS，但不會(huì)誘發(fā)自身的胰島素分泌。利用雙光子激發(fā)成像的NAD（P）H，細(xì)胞質(zhì)和線粒體信號(hào)分離，所述研究表明，β-細(xì)胞代謝丙酮酸，雖然瞬時(shí)。這樣一個(gè)短暫的線粒體反應(yīng)表明兩個(gè)獨(dú)立的模型，目前正在研究：要么線粒體丙酮酸運(yùn)輸或三元周期后期丙酮酸代謝過(guò)程中被抑制。利用雙光子激發(fā)技術(shù)，生活胰島被反復(fù)掃描，以產(chǎn)生數(shù)據(jù)采樣的時(shí)間間隔是通過(guò)生物 化學(xué)的方法無(wú)法得到的。此類型的重復(fù)成像根本不能使用共聚焦顯微鏡進(jìn)行，因?yàn)橥ㄟ^(guò)光漂白和紫外線光引起的光損傷的限制。

由于雙光子激發(fā)顯微鏡利用鎖模激光器（脈沖），它可以很容易地?cái)U(kuò)展到組合與熒光壽命成像。基于納秒熒光衰減時(shí)間的圖像提供的信息是獨(dú)立的熒光濃度。一個(gè)潛在的應(yīng)用是利用熒光壽命成像，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）效率兩個(gè)探針之間取得一個(gè)明確的值。在*近的一項(xiàng)調(diào)查，雙光子激發(fā)的壽命成像顯微鏡的NAD（P）H的定量測(cè)定在不同的亞細(xì)胞的NAD（P）H +濃度。NADH水平，在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)輔阻遏芽期耐冷性，這是在細(xì)胞周期調(diào)控的參與者和改造轉(zhuǎn)錄途徑。通過(guò)雙光子激發(fā)顯微鏡的NAD（P）H和壽命成像的結(jié)合使用，它表明，在細(xì)胞核中的自由的NADH水平密切對(duì)應(yīng)的半*大濃度為CTBP綁定。

雙光子激發(fā)的技術(shù)可以結(jié)合范圍廣泛的其他建立的生物物理技術(shù)，包括熒光相關(guān)光譜（FCS）和熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）。這些技術(shù)中的每一個(gè)通常利用固定單光子（連續(xù)波）激光。FCS技術(shù)確定的職業(yè)數(shù)量和熒光探針固定光束的焦點(diǎn)體積內(nèi)的擴(kuò)散特性，并已成功地應(yīng)用在分子間的相互作用和擴(kuò)散研究。通過(guò)控制激光焦點(diǎn)區(qū)域，然后通過(guò)觀察熒光恢復(fù)熒光漂白，F(xiàn)RAP已經(jīng)來(lái)研究宏觀的熒光分子擴(kuò)散。這兩種FCS和FRAP技術(shù)已被廣泛使用，以調(diào)查對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞膜熒光探針的擴(kuò)散特性的。**為止，這些技術(shù)的復(fù)雜性限制了它們的應(yīng)用程序，在體外系統(tǒng)中，細(xì)胞培養(yǎng)模型。定量數(shù)據(jù)時(shí)，需要從任一方法，在雙光子激發(fā)顯微鏡定義良好的激發(fā)體積是一個(gè)優(yōu)勢(shì)。此外，F(xiàn)CS和FRAP可以預(yù)期在比單光子激發(fā)的研究雙分子動(dòng)力學(xué)，在厚的活組織，而采用雙光子是非常有價(jià)值的。

深試樣的滲透與雙光子激發(fā)獲得允許在體內(nèi)成像，雖然成像時(shí)必須克服一系列的挑戰(zhàn)生活的動(dòng)物。可通過(guò)雙光子激發(fā)體內(nèi)熒光成像通過(guò)手術(shù)的開(kāi)孔在活的動(dòng)物的皮膚，或通過(guò)“窗口”蓋玻片放置到動(dòng)物。另外一個(gè)活的動(dòng)物工作的并發(fā)癥是熒光標(biāo)記標(biāo)本的難度相當(dāng)大。一個(gè)發(fā)表的研究報(bào)告，使用的Ca2 +指示劑在活老鼠的神經(jīng)元特異性標(biāo)記，允許監(jiān)測(cè)神經(jīng)功能，采用雙光子激發(fā)技術(shù)。綠色熒光蛋白（GFP）的熒光標(biāo)記特定器官和蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的表達(dá)肯定會(huì)導(dǎo)致額外的應(yīng)用程序的雙光子激發(fā)，在體內(nèi)成像。由于活標(biāo)本的可能性，將在成像過(guò)程中移動(dòng)，體內(nèi)研究的大多數(shù)當(dāng)前與麻醉動(dòng)物，成像率增加，以限制這個(gè)運(yùn)動(dòng)的效果。它很可能是未來(lái)的技術(shù)進(jìn)步，如直接安裝到活體的小型化雙光子顯微鏡，將允許在自由活動(dòng)動(dòng)物的體內(nèi)成像。

一些研究人員采用批量裝載鈣指示劑結(jié)合的雙光子激發(fā)顯微鏡映射的神經(jīng)元在小鼠腦片的微型電路。他們的方法是觸發(fā)信號(hào)的神經(jīng)元，然后發(fā)起所謂的“跟隨者”的神經(jīng)元連接的鈣信號(hào)映射。確定新皮層是由眾多的正是組織的微電路。確定的追隨者屬于幾個(gè)區(qū)分解剖類和它們的位置，可以預(yù)測(cè)在不同的動(dòng)物。

一個(gè)潛在的非常**的應(yīng)用程序的雙光子激發(fā)顯微三維分辨光致籠化合物，簡(jiǎn)稱為的uncaging。例如，定量的雙光子激發(fā)鈣的uncaging了許多技術(shù)的焦點(diǎn)。正如先前所討論的，光化學(xué)的uncaging的反應(yīng)通常是相當(dāng)慢（范圍從毫秒到秒），它允許物鏡化合物的激發(fā)時(shí)，它成為活躍的時(shí)間之間的試樣內(nèi)擴(kuò)散*過(guò)幾微米。的擴(kuò)散不存在某些應(yīng)用中，如“標(biāo)記”的的細(xì)胞uncaging膜無(wú)常熒光分子中的一個(gè)問(wèn)題。一組調(diào)查人員已經(jīng)成功地使用雙光子激發(fā)光解釋，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡，追蹤海膽胚胎細(xì)胞系的發(fā)展。

更快的反應(yīng)的uncaging分子已被成功地利用由其他研究人員在調(diào)查的的興奮劑uncaging，它們采用雙光子激發(fā)的地圖神經(jīng)元受體。在這些研究的過(guò)程中，光化學(xué)的uncaging的擴(kuò)大利用出籠興奮劑控制的位置，在成像介質(zhì)的雙光子激發(fā)的三維性質(zhì)。細(xì)胞膜附近開(kāi)鎖興奮劑，它刺激受體在靠近，通過(guò)膜片鉗細(xì)胞的過(guò)程中被檢測(cè)到的。在這種類型的成像，測(cè)量興奮性反應(yīng)，而不是發(fā)射光子映射圖像。作為具體的例子，連同用于信號(hào)檢測(cè)的全細(xì)胞鉗的的的uncaging MNI-谷氨酸成功映射谷氨酸受體。標(biāo)本培養(yǎng)海馬神經(jīng)元和海馬CA1錐體神經(jīng)元的急性片制劑。進(jìn)行這項(xiàng)研究的研究人員能夠獲得優(yōu)異的側(cè)向和軸向的全寬度半*大值（FWHM）為0.6和1.4毫米的直徑，分別切片中的制劑，指示快速的uncaging反應(yīng)時(shí)間。進(jìn)一步確定，蘑菇棘豐富的α-氨基-3 -羥基-5 -甲基-4 -異唑丙酸（AMPA）型谷氨酸受體，這些受體的分布是高度相關(guān)的脊柱幾何。

結(jié)論

雙光子激發(fā)顯微厚的完整的組織標(biāo)本，如動(dòng)態(tài)的活細(xì)胞成像提供了巨大的效用。該技術(shù)使得有可能多次實(shí)驗(yàn)中，不能執(zhí)行傳統(tǒng)的成像，或?qū)o(wú)法提供所需的信息。依托鎖模（脈沖）激光照射產(chǎn)生足夠的光子密度的焦點(diǎn)，雙光子激發(fā)只發(fā)生在焦平面。局域激發(fā)的好處是，排放量被限制在狹窄的焦點(diǎn)區(qū)域，提供切片的能力，而不使用一個(gè)針孔。此外，激發(fā)區(qū)域有限，因?yàn)楣鈸p傷主要限于焦量，降低了光毒性。

雙光子激發(fā)顯微鏡雖然不產(chǎn)生更高的分辨率比共聚焦顯微鏡的圖像，但是它允許使用厚的樣品的穿透深度增加。的更大的穿透深度是可能的，部分原因是打開(kāi)針孔幾何形狀的雙光子顯微鏡，聚焦的激發(fā)光的吸收的情況下，減少散射的激發(fā)光（因?yàn)樗牟ㄩL(zhǎng)）。為了充分利用深度滲透，必須使用非退掃描檢測(cè)幾何形狀影響散射熒光光子收集效率急劇增加。雙光子激發(fā)的優(yōu)點(diǎn)，被清楚地確定，并允許進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)將是不可能的，利用共聚焦顯微鏡。由于這種技術(shù)的好處從可預(yù)測(cè)的技術(shù)改進(jìn)和成本降低，并且變得更加流行的，它被預(yù)期，將實(shí)現(xiàn)越來(lái)越多的令人振奮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。