術(shù)語“螢光蛋白”結(jié)合了一組基因改變的熒光蛋白，具有非常特殊的屬性：它們可以從一個(gè)非熒光狀態(tài)激活，他們可以改變他們的發(fā)射光譜或進(jìn)行切換和關(guān)閉，他們甚至能夠“為很多次。此行為是由于一些獨(dú)特的照片的物理屬性。在單分子水平，許多熒光蛋白顯示閃爍的活動(dòng)可以由外部照明的影響的特性。有明顯分別發(fā)射和非發(fā)射新的發(fā)射狀態(tài)，所表達(dá)的內(nèi)容屬性光可活化，photoconvertible的的或光開關(guān)，光學(xué)熒光筆蛋白突變的熒光蛋白。另一個(gè)有趣的類型的熒光蛋白熒光定時(shí)器能夠改變它們的顏色隨著時(shí)間的推移。下面的文章將給予這些“特殊”的熒光蛋白的選擇的概述。

光活化的蛋白

光活化的蛋白可以“接通”從低熒光狀態(tài)到一個(gè)更高的熒光狀態(tài)。此開關(guān)期間發(fā)生的事件的第二小于施加短暫的光脈沖在紫色/藍(lán)色光譜，并允許動(dòng)態(tài)細(xì)胞過程的檢測。感興趣的區(qū)域（ROI）中的分子定向光活化可用于監(jiān)測這些被激活的細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)。而像FRAP在其他脈沖追逐的實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)不能區(qū)分蛋白質(zhì)重新進(jìn)入的投資回報(bào)率和新合成的分子，光敏繞過這個(gè)問題的方法之一。

第一光活化的蛋白是一個(gè)wtGFP變體，并，，由Lippincott-Schwarz和帕特森已經(jīng)建立。它包括的單點(diǎn)突變（T203H），這會(huì)導(dǎo)致一個(gè)非常低的區(qū)域從450到550nm的吸光度。被光活化與紫色光的幫助下，PA-GFP（綠色熒光蛋白光活化的）開關(guān)從400到504 nm的最大吸收。因此，其熒光增加CA。100倍，當(dāng)用波長為488 nm，什么樣的是反映在激活的和未激活的蛋白之間形成了鮮明對比激發(fā)[ 1 ]。

PA-GFP的激活過程中的基本過程似乎是谷氨酸的側(cè)鏈殘基222的光致脫羧。這種損失的二氧化碳改變了發(fā)色基團(tuán)的配置從一個(gè)中性的陰離子狀態(tài)[ 2 ]。

這里應(yīng)該提到另一個(gè)候選是Phamret（光活化介導(dǎo)的共振能量轉(zhuǎn)移），這是一個(gè)特殊的串聯(lián)二聚體的熒光蛋白，光活化的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。phamret的融合蛋白組成的一個(gè)PA-綠色熒光蛋白的共價(jià)耦合到FRET伙伴ECFP。在480 nm到458 nm波長的曝光導(dǎo)致排放ECFP。相鄰光敏PA-GFP有405nm的激光束。在這之后，反復(fù)暴露于458納米導(dǎo)致FRET激發(fā)ECFP和PA-GFP之間的，在綠色熒光。因此，“無效”和“活躍”的形式，可以激發(fā)出相同的激光波長。可能是負(fù)的特性的蛋白質(zhì)的大小，這是由兩個(gè)熒光蛋白，可能喚起空間位阻問題。

值得注意的是，光活化的蛋白通常顯示降低亮度相比，EGFP的耐光性降低，并顯示出。

圖 1：光激活FPS可以切換“開”藍(lán)色/紫色光譜光照射在熒光狀態(tài)從非熒光狀態(tài)。Photoconvertable的FPS是能夠改變他們的熒光發(fā)射光譜，從一個(gè)到另一個(gè)最大。這也被觸發(fā)，通過曝光與目標(biāo)波長的光?？梢郧袚Q光開關(guān)的FP“開和關(guān)”的兩個(gè)不同波長的光脈沖的幫助。該循環(huán)可以執(zhí)行至幾百倍。改變其發(fā)射光譜熒光計(jì)時(shí)器時(shí)間。在他們的幫助下，它是可能的關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)，例如年齡和蜂窩位置

Photoconvertible蛋白質(zhì)

在光活化的蛋白相比，photoconvertible發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)已經(jīng)在他們的非轉(zhuǎn)換的狀態(tài)。因此，它是更容易定義您的投資回報(bào)率。光電轉(zhuǎn)換被發(fā)現(xiàn)在石開腦珊瑚Trachyphyllia geoffroyi中。由于其排放的屬性，正在從綠色變?yōu)榧t色光轉(zhuǎn)化后用紫外光，熒光蛋白被命名為楓像日本槭樹的葉子[ 4 ]。秋天，他們把顏色從綠色變?yōu)榧t色。如果楓380和400納米之間的波長，其最大發(fā)射光轉(zhuǎn)換正在發(fā)生變化，從518納米到582納米。這顯示在綠色和紅色熒光的因素2,000之間的比例大幅改變。這種轉(zhuǎn)換是不可逆的。另一個(gè)限制因素是楓四聚體的性質(zhì)，是什么使活細(xì)胞成像研究它，而沒有吸引力。

光轉(zhuǎn)化的基本過程又是一個(gè)光誘導(dǎo)過程。在這種情況下，內(nèi)部的發(fā)色團(tuán)（His61-Tyr63-Gly64）組氨酸殘基被裂解的照射，并最終導(dǎo)致一個(gè)形成一個(gè)高度共軛的雙咪唑環(huán)系統(tǒng)。這個(gè)過程被連接到紅色波長[ 2 ] 熒光移位。

一個(gè)紅色綠色兌換FP來自珊瑚Dendronephtytha SP。它的名字和紅色的激活屬性都反映表達(dá)將Dendra [ 5 ]。商業(yè)發(fā)展Dendra2是第一單體紅-綠色photoconvertible的蛋白質(zhì)。

另一種廣泛使用的光學(xué)熒光筆tdEosFP [ 6 ]，主要是從Labophyllia hemprichii，石珊瑚隔離。串聯(lián)二聚體可以轉(zhuǎn)換從綠色到紅色熒光的近紫外線照射后，欣然用于超分辨率顯微鏡，什么是真正的單體版本MEOS mEos2個(gè)。

非常相似的特征Keadeàphotoconvertible的蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)在第三個(gè)石珊瑚：法維亞瘌痢。近紫外線照射四聚體KikGR的后改變其熒光從綠色變?yōu)榧t色，但在一個(gè)更美好的方式比楓。其商業(yè)的變體被稱為Kikume，可以用750 nm波長的多光子激發(fā)的光轉(zhuǎn)換。類似這樣的，它可以被用來在厚的組織標(biāo)本。突變導(dǎo)致KikGR單體形式mKikGR的。連同與mEos2 Dendra2它是一個(gè)經(jīng)常使用的光學(xué)超分辨成像熒光筆。

光開關(guān)染料

而光敏化是一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)換，從一個(gè)非熒光狀態(tài)的熒光狀態(tài)，光開關(guān)蛋白能兩個(gè)條件之間的班車。不同波長的光脈沖，這些熒光蛋白的幫助，可以打開和關(guān)閉的幾百倍不漂白。熒光燈和暗態(tài)之間進(jìn)行切換，這樣的現(xiàn)象，被稱為光致變色的，已經(jīng)顯示了在單分子水平wtGFP，但一個(gè)非常低的延伸。

一個(gè)眾所周知的光開關(guān)的蛋白質(zhì)，它是用來在超高分辨率顯微鏡，是來自于一個(gè)石珊瑚：Dronpa是單體，并在390 nm處的最大吸收波長為503納米，由于它的陰離子，去質(zhì)子化的發(fā)色團(tuán)，有小absoption最大由于它的中性，質(zhì)子化的發(fā)色團(tuán)。而陰離子形式在518 nm處具有最大發(fā)射，中性的形式描繪了一個(gè)非熒光狀態(tài)。此外，還有一個(gè)順式-反式異構(gòu)化，質(zhì)子化的發(fā)色團(tuán)連接。的發(fā)色基團(tuán)的中性態(tài)Tyr66的側(cè)鏈中的反式構(gòu)型（第2圖）。在其陰離子國家Tyr66具有順式構(gòu)象。有405nm照射后，被強(qiáng)制進(jìn)入激光脈沖Dronpa的熒光順式構(gòu)象。488 nm激光脈沖然后切換Dronpa的構(gòu)象非熒光反狀態(tài)。該循環(huán)可以重復(fù)幾百次。

圖2：使用超高分辨率顯微鏡的光開關(guān)蛋白Dronpa的

四聚體蛋白在紅色區(qū)域的最大發(fā)射光開關(guān)Kindling FP（KFP1）。

最新努力創(chuàng)造新的光學(xué)熒光筆想出了這是一種蛋白質(zhì)，光電轉(zhuǎn)換和光控相結(jié)合。IrisFP是一個(gè)wtEosFP的一個(gè)開和關(guān)的開關(guān)狀態(tài)，以及其綠色熒光紅色熒光構(gòu)衍生。換句話說，照射高強(qiáng)度的405nm的激光束IrisFP后轉(zhuǎn)移從綠色到紅色的發(fā)光狀態(tài)。格林IrisFP的可以被關(guān)掉的幫助下為488 nm的激光。在405納米的低強(qiáng)度激光開關(guān)再次打開。紅IrisFP另一方面關(guān)閉用532 nm的激光的光，并且可以具有440 nm的激光再次接通。相鄰的建設(shè)單體形式mIrisFP的打開門為進(jìn)一步的應(yīng)用[ 3 ]。

熒光計(jì)時(shí)器

正在改變他們的發(fā)射光譜的時(shí)間被稱為熒光蛋白的熒光計(jì)時(shí)器。此行為是不pH值的變化，離子強(qiáng)度或蛋白質(zhì)濃度的結(jié)果，但獨(dú)立于這些生化指標(biāo)發(fā)生。換句話說有關(guān)的蛋白的年齡可以估算它的顏色。具有這些特征的，有可能測量在活細(xì)胞內(nèi)的時(shí)間-時(shí)間取決于發(fā)生的事情- 。

在2000年，由實(shí)驗(yàn)室的謝爾蓋·A.盧科亞諾夫第一熒光定時(shí)器描述。這種紅色熒光蛋白突變體命名為FT（熒光定時(shí)器）改變其發(fā)射光譜在18小時(shí)期間從紅色到綠色波長。由于這樣的事實(shí)，F(xiàn)T的四聚體Vladislav Verkhusha的看到有必要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)單體的。突變的mCherry導(dǎo)致3熒光定時(shí)器，具有不同的轉(zhuǎn)換時(shí)間。這些蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)向快速，中速或慢速的時(shí)間尺度從藍(lán)色到紅色，但仍然太慢測量細(xì)胞在幾分鐘內(nèi)發(fā)生的進(jìn)程（S. 表1）。

然而，隨著熒光計(jì)時(shí)器的幫助下，它未能觀看蛋白在活細(xì)胞中，無論是在空間和時(shí)間分辨率的行為。例如，分化和細(xì)胞極化過程可以觀察到。此外，蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)氖录虿《狙b配可以跟蹤或基因的活性可以被監(jiān)控。該應(yīng)用程序列表中一定能進(jìn)行擴(kuò)展和顯示熒光定時(shí)器在未來的潛在用途

表1：螢光蛋白和熒光計(jì)時(shí)器

Exmax：最大激發(fā)，Emmax：最大發(fā)射，QY：量子產(chǎn)率，亮度計(jì)算量子產(chǎn)率和摩爾消光系數(shù)的乘積除以1,000