標(biāo)本的照明是最重要的變量，在實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)的圖像在顯微鏡和顯微攝影的關(guān)鍵?？评照彰髦惺状我肓?893年8月克勒(K?hler)的卡爾·蔡司公司提供最佳的標(biāo)本照明的方法。

建議所有制造商的現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室顯微鏡這種技術(shù)，因?yàn)樗梢援a(chǎn)生樣品是均勻的亮度和眩光的照明，從而使用戶實(shí)現(xiàn)顯微鏡的全部潛力。

制造商已經(jīng)設(shè)計(jì)現(xiàn)代顯微鏡，使集電極透鏡和進(jìn)入顯微鏡的基礎(chǔ)上構(gòu)建的組件的任何其它光學(xué)的孔徑光闌的正確定位的載物臺(tái)下聚光的平面上投影的放大和聚焦圖像的燈絲。關(guān)閉或打開(kāi)聚光鏡隔膜控制新興的從聚光鏡和從所有方位角到達(dá)標(biāo)本的光線角度。因?yàn)?a title='光源' target='_blank' class='seolabel'>光源沒(méi)有被聚焦在水平的標(biāo)本，在標(biāo)本的水平的光基本上是grainless和擴(kuò)展，不會(huì)受到從聚光鏡玻璃表面上的灰塵和不完善的劣化。聚光鏡孔徑光闌的打開(kāi)和關(guān)閉的控制的角度到達(dá)檢體的光錐。聚光鏡的孔徑光闌的設(shè)置，以及與孔的物鏡，確定實(shí)現(xiàn)的數(shù)值孔徑的顯微鏡“系統(tǒng)”。作為聚光鏡振動(dòng)板被打開(kāi)時(shí)，正常工作的數(shù)值孔徑的顯微鏡的增加，導(dǎo)致更大的分辨力和光透射率。平行光線通過(guò)并照亮標(biāo)本帶來(lái)集中在后焦平面的物鏡變量，聚光鏡孔徑光闌的圖像和圖像的光源，其中，可以看出，在焦點(diǎn)。

光路徑在圖1中示出的示意性繪制表示所采取的檢體照射光射線和圖像形成的光線的單獨(dú)的路徑。這是沒(méi)有這些途徑任何真正的偏析，但一個(gè)真正的代表性的可視化和討論的目的提出的圖解表示。圖1（a）示出的后焦平面上的物鏡，和視點(diǎn)（也稱為Ramsden圓盤(pán)）照明光的射線路徑產(chǎn)生一個(gè)聚焦圖像的燈絲平面載物臺(tái)下聚光孔徑光闌，目鏡。共同的焦點(diǎn)是在這些區(qū)域通常被稱為作為共軛平面，這是至關(guān)重要的，實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)目评照彰?。根?jù)定義，在一個(gè)平面上的對(duì)象，該對(duì)象是在焦點(diǎn)也聚焦在其他的共軛平面，光通路。在每一個(gè)光通路（包括圖像形成和照明），有四個(gè)獨(dú)立的平面，它們一起組成的共軛平面集。

科勒照明的照明的光線的路徑的共軛平面中（圖1（a））包括：
·燈絲。
·聚光鏡孔徑光闌（在聚光鏡的前焦平面）。
·后焦平面上的物鏡。
·視點(diǎn)（也稱為Ramsden圓盤(pán)）的目鏡，這是位于約二分之一英寸（1厘米），在頂端透鏡的目鏡上方觀察者把前面的眼睛觀察時(shí)的地步。

同樣地，在成象科勒照明光路中（圖1（b））的共軛平面包括：

·視場(chǎng)光闌。
·集中的標(biāo)本。
·平面（即，平面的固定光闌的目鏡）的中間圖像。
·眼的視網(wǎng)膜的照相機(jī)或膠片面。

共軛焦平面通常是有用的，在顯微鏡進(jìn)行故障排除污染的光學(xué)元件中的灰塵，纖維，和不完善。如果這些文物是大家關(guān)注的焦點(diǎn)，因此，它們必須位于或接近表面的成像形成的共軛平面的一部分。這個(gè)集合的成員包括玻璃元件在顯微鏡光端口，樣品，在目鏡的分劃板，和底部的透鏡元件的目鏡。另外，如果這些污染物模糊和重點(diǎn)，找他們共享共軛平面附近的照明。在這個(gè)類(lèi)別聚光鏡頂部透鏡（如灰塵和污垢常常累加），暴露的目鏡透鏡元件（從睫毛污染物），和物鏡前透鏡（通常指紋污跡）。

圖2示出一個(gè)典型的顯微鏡安裝在燈殼體（照明源）連接到基座和投射光被反射后，由反射鏡在顯微鏡底座通過(guò)幾個(gè)鏡頭和然后通過(guò)載物臺(tái)下聚光。光源本身應(yīng)該顯微鏡的光軸precentered或定心。從鎢 - 鹵燈燈絲發(fā)射的光首先通過(guò)靠近燈殼體通過(guò)聚光透鏡，然后再通過(guò)接近視場(chǎng)光闌的第二透鏡。通常情況下，燒結(jié)的或磨砂的玻璃過(guò)濾器放置之間的燈，和集電極透鏡的光擴(kuò)散，并確保一個(gè)偶數(shù)的照明強(qiáng)度。在實(shí)踐中，燈絲的圖像被聚焦在玻璃擴(kuò)散器的聚光鏡的前焦面，而被暫時(shí)從光路中除去。集電極透鏡的焦距必須仔細(xì)燈絲尺寸相匹配，以確保適當(dāng)?shù)拇笮?，一個(gè)燈絲圖像投射到聚光鏡孔徑。對(duì)于正確的科勒照明，圖像的燈絲應(yīng)完全填補(bǔ)的聚光鏡光圈。

所述第二透鏡的光路中被稱為場(chǎng)透鏡，它是負(fù)責(zé)使燈絲的圖像在載物臺(tái)下聚光孔徑光闌的平面成焦點(diǎn)。 （放置在一個(gè)45度角度光路徑），通過(guò)視場(chǎng)光闌，并進(jìn)入載物臺(tái)下聚光反射鏡反射的聚焦的光場(chǎng)透鏡離開(kāi)。視場(chǎng)光闌作為一個(gè)虛擬源的光的顯微鏡，其圖像被聚焦到樣品平面聚光鏡。這些元素的布置的光學(xué)設(shè)計(jì)由顯微鏡制造商可能會(huì)有所不同，但應(yīng)被定位在一個(gè)足夠的距離，從場(chǎng)透鏡，消除灰塵和鏡頭缺陷的標(biāo)本平面成像視場(chǎng)光闌。

在基座的顯微鏡視場(chǎng)光闌的寬度僅控制束光線到達(dá)聚光鏡 - 它不影響的光學(xué)分辨率，數(shù)值孔徑，或者照明的強(qiáng)度。的視場(chǎng)光闌（即，集中在光路中，并打開(kāi)，以便剛好位于的視場(chǎng)以外的）的適當(dāng)調(diào)整是很重要的，以防止眩光比可以降低所觀察到的圖像中的對(duì)比度。消除多余的光線是特別重要的，當(dāng)試圖固有的低對(duì)比度圖像樣本。當(dāng)視場(chǎng)光闌開(kāi)得遠(yuǎn)，從標(biāo)本在傾斜的角度從光學(xué)表面的反射光，散射光可以采取行動(dòng)，降低圖像的質(zhì)量。

載物臺(tái)下聚光鏡的顯微鏡載物臺(tái)的下方通常直接安裝在一個(gè)托架，可以提高或降低獨(dú)立的階段，如在圖2中示出通過(guò)旋轉(zhuǎn)滾花旋鈕。孔徑光闌被打開(kāi)和關(guān)閉一個(gè)擺動(dòng)臂，桿，或通過(guò)旋轉(zhuǎn)聚光鏡殼體上的軸環(huán)。應(yīng)該注意的是，載物臺(tái)下聚光鏡是正確的調(diào)整可能是最重要的方面實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)目评照彰?。然而，不幸的是，聚光鏡偏差和調(diào)整不當(dāng)聚光鏡光圈隔膜的圖像質(zhì)量下降和質(zhì)量差的顯微攝影的主要來(lái)源。

當(dāng)適當(dāng)調(diào)整時(shí)，來(lái)自聚光鏡的光將與圖像形成光通過(guò)投射光錐，照亮領(lǐng)域的視圖（詳盡地討論載物臺(tái)下聚光鏡填補(bǔ)的后焦平面的物鏡包括在另一部分中的引物）。聚光鏡孔徑光闌是負(fù)責(zé)控制的照明光錐的角度，因此，在聚光鏡的數(shù)值孔徑。這個(gè)概念在圖3中示出，其中一系列與光錐（數(shù)值孔徑）的減小尺寸圖中從左至右示出的聚光鏡。聚光鏡光錐形狀也是光學(xué)像差的校正的程度的函數(shù)

圖3（a）示出了聚光鏡的數(shù)值孔徑約為1.20，具有廣闊的允許的試樣具有高的數(shù)值孔徑物鏡成像的光錐。圖3（BD）顯示了如何減少的孔徑光圈的大小會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的光錐的大小以及數(shù)值孔徑的減少（圖3（b）NA= 0.60，圖3（c），NA =0.30，圖3（d ）NA= 0.15）。我們還構(gòu)建了一個(gè)互動(dòng)的Java教程，演示了如何聚光鏡光錐的大小和形狀各不相同數(shù)值孔徑。

重要的是要注意，相對(duì)于聚光鏡光錐的大小和形狀，即僅減少視場(chǎng)光闌的大小稍微減小的尺寸在圖3中示出的光錐的下部。的角度和數(shù)值孔徑的光錐與視場(chǎng)光闌的大小減少，基本上保持不變。 ，常常由新手忽視，另一個(gè)重要的概念是，不應(yīng)該被控制，通過(guò)打開(kāi)和關(guān)閉聚光鏡孔徑光闌，也不是由聚光鏡轉(zhuǎn)移顯微鏡光學(xué)中心相對(duì)于軸向的照度。光照強(qiáng)度只應(yīng)通過(guò)使用中性密度過(guò)濾器放置到光路中，或通過(guò)降低電壓的燈（盡管后者通常還沒(méi)有建議，特別是對(duì)顯微攝影）控制。鎢鹵素?zé)?，以確保最高的性能，請(qǐng)參考生產(chǎn)商的儀器手冊(cè)，以確定最佳的燈電壓（通常為6-10伏），并使用該設(shè)置。的照明亮度，然后，可以容易地控制中性密度過(guò)濾器通過(guò)添加或刪除。

載物臺(tái)下聚光孔徑光闌的大小不僅應(yīng)該一致所需的數(shù)值孔徑，但也應(yīng)考慮所得到的圖像的質(zhì)量。通常，孔徑光圈應(yīng)該被調(diào)整，以提供足夠的圖像的對(duì)比度，而不被關(guān)閉的點(diǎn)引入的分辨率和細(xì)節(jié)的損失。折光指數(shù)和固有的標(biāo)本對(duì)比度確定的孔徑光圈的大小是非常重要的。在一般情況下，隔膜應(yīng)設(shè)置為60至90％的整個(gè)光盤(pán)大小（可見(jiàn)在眼管除去目鏡后或與伯特蘭透鏡）的位置，使上，雖然這可能會(huì)隨極端標(biāo)本對(duì)比度。

聚光鏡光圈設(shè)置由顯微攝影拍攝的圖像的質(zhì)量的影響在圖4中示出。樣品是薄款的椴樹(shù)（椴木）干與固綠的曙紅染色和使用的40倍Planachromat物鏡（NA =0.75）和旋出頂部透鏡消色差聚光鏡（NA =0.90）Fujichrome 64T透明膠片拍攝的。近似聚光鏡光圈孔徑設(shè)置為：圖4（a） - 90％（NA =0.81），圖4（b） - 60％（NA =0.54），圖4（c） - 20％（NA =0.18）。組織部分是選擇性的顏色染色透露精致的細(xì)節(jié)和亞細(xì)胞成分差異的觀察。

在圖4（a），其中孔徑光闌被設(shè)置到一個(gè)位置，在該位置的聚光鏡和客觀的數(shù)值孔徑，幾乎是相同的，大部分的細(xì)試樣細(xì)節(jié)是可見(jiàn)的，但仍然有相當(dāng)數(shù)量的散射和眩光。也是顯著的圖像的亮度比其同行，其中的孔徑光闌與一個(gè)較小的設(shè)置作了。圖4（b）示出的椴樹(shù)莖標(biāo)本，聚光鏡光圈大小，物鏡產(chǎn)生約70％數(shù)值孔徑。減少了眩光，圖像是非常尖銳的，精細(xì)的圖像細(xì)節(jié)是不顯著的衍射文物。對(duì)于該標(biāo)本，在圖4（b）表示的顯微照片聚光鏡孔徑光闌的最佳設(shè)定。當(dāng)光圈已關(guān)閉設(shè)置到最小的在25％左右的物鏡數(shù)值孔徑（圖4（c）），精細(xì)的圖像細(xì)節(jié)變得模糊，與的衍射文物和折射現(xiàn)象。圖像也需要較暗的整體投射，產(chǎn)生的檢體中色調(diào)變化。

從上面的討論，這是顯而易見(jiàn)的，應(yīng)該被設(shè)置為提供一個(gè)折衷的混合物的直接和偏離光，在很大的程度上取決于試樣的吸收，衍射和折射特性的位置，將聚光鏡孔徑光闌。這必須完成，沒(méi)有鋪天蓋地的圖像與文物，晦澀的細(xì)節(jié)和目前錯(cuò)誤的對(duì)比度提高。必要以產(chǎn)生最好的顯微照片的圖像的細(xì)節(jié)和對(duì)比度的量也依賴于折射率，光學(xué)特性和其他試樣相關(guān)的參數(shù)。

當(dāng)孔徑光闌被錯(cuò)誤地關(guān)閉太多，偏離光開(kāi)始模糊直接照明光線，導(dǎo)致引起可見(jiàn)條紋的衍射工件，帶狀物，和/或圖案形成的顯微照片。其他問(wèn)題，如折射現(xiàn)象，也可以產(chǎn)生明顯的結(jié)構(gòu)是不是真正的圖像。另外，打開(kāi)聚光鏡的光圈太寬，從標(biāo)本，在顯微鏡的光學(xué)表面產(chǎn)生多余的眩光和光散射。這會(huì)導(dǎo)致圖像細(xì)節(jié)的對(duì)比度和洗出到一個(gè)顯著損失。正確的設(shè)置會(huì)有所不同從標(biāo)本，和有經(jīng)驗(yàn)的顯微鏡技術(shù)很快將學(xué)會(huì)準(zhǔn)確地調(diào)整聚光鏡的孔徑光闌（及系統(tǒng)的數(shù)值孔徑），而無(wú)需通過(guò)觀察圖像，以查看在光圈中的后焦平面的物鏡。事實(shí)上，在顯微攝影，許多顯微鏡認(rèn)為關(guān)鍵減少的顯微鏡系統(tǒng)的數(shù)值孔徑，以優(yōu)化圖像質(zhì)量是最重要的一步。

在顯微鏡的照明系統(tǒng)中，調(diào)整為適當(dāng)?shù)目评照彰鲿r(shí)，必須滿足幾個(gè)要求。標(biāo)本平面的照明面積必須是至少一樣大的視場(chǎng)任何給定的物鏡。此外，光必須是均勻的強(qiáng)度的數(shù)值孔徑必須從最大（等于物鏡）最小的值，該值將取決于試樣的光學(xué)特性的變化。表1為每一個(gè)物鏡列出了物鏡的數(shù)值孔徑，范圍從很低到很高的放大倍數(shù)與磁場(chǎng)的觀點(diǎn)直徑（目鏡的視場(chǎng)數(shù)18）。

從表1中所給出的數(shù)據(jù)，很明顯，從1x Planachromat到100倍Planapochromat字段中的變化的觀點(diǎn)直徑是100倍。這將產(chǎn)生一個(gè)驚人的1x和100倍的物鏡之間面積上照度在10,000倍的差異。這樣寬的范圍內(nèi)照明領(lǐng)域需要調(diào)整的光路中的許多組件，以容納所有的放大倍率。這些計(jì)算假設(shè)目鏡視場(chǎng)數(shù)為18，但許多現(xiàn)代的顯微鏡都配有寬視野目鏡的市場(chǎng)數(shù)20或25。視野的字段（如表1中的第三列中給出的），可以重新計(jì)算的任何目鏡使用下面的公式：

D = (FN) / M
其中D是的視場(chǎng)直徑，F(xiàn)N是目鏡視野數(shù)，M是物鏡放大倍率。

現(xiàn)代顯微鏡都配有專(zhuān)門(mén)的的載物臺(tái)下聚光鏡，有一個(gè)擺動(dòng)離開(kāi)透鏡，它可以從光路的使用低功率的物鏡（2倍至5倍）除去。這改變了在光路中的其余組件的性能，和一些調(diào)整是必要的，以達(dá)到最佳的照明條件。視場(chǎng)光闌可以不再被用于對(duì)齊和定心載物臺(tái)下聚光，現(xiàn)在是在光照條件下的樣本區(qū)域限制無(wú)效。此外，一旦除去視場(chǎng)光闌，多余的眩光被減少，因?yàn)樵诰酃忡R產(chǎn)生最佳透鏡的光錐，具有低得多的數(shù)值孔徑，使光線穿過(guò)試樣，在低得多的角度。最重要的是，科勒照明的光學(xué)條件不再適用。

應(yīng)始終對(duì)準(zhǔn)顯微鏡的光學(xué)元件和科勒照明條件的建立在更高的（10倍）的放大倍率進(jìn)行之前除去擺動(dòng)離開(kāi)工作以低級(jí)（5x和下文）的放大倍率的聚光透鏡。然后，在聚光鏡的高度應(yīng)不被改變。擺動(dòng)上透鏡從光路中搖出，聚光鏡的性能從根本上改變。不再形成的燈絲的圖像中的孔徑光闌，其中停止控制在聚光鏡和照明系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。事實(shí)上，應(yīng)完全打開(kāi)的光圈光闌以避免漸暈，光在視場(chǎng)邊緣逐步衰落。

在圖5示出修改后的用于在低功率顯微鏡系統(tǒng)的透射光的光學(xué)路徑。視場(chǎng)光闌現(xiàn)在定位在正確的平面作為孔徑光闌，以控制照明和成象光線穿過(guò)聚光鏡的數(shù)值孔徑的大小和形狀的光錐。標(biāo)本平面充分照明的等角視錐細(xì)胞（如在科勒照明），但是燈絲現(xiàn)在在背面的鏡頭卡口的物鏡，而不是后焦平面成像。

重要的是要注意，視場(chǎng)光闌的圖像不再是在標(biāo)本平面形成的，雖然仍然是均勻的視場(chǎng)范圍內(nèi)的整體強(qiáng)度的照明，提供燈聚光透鏡稍有擴(kuò)散（化學(xué)蝕刻）或磨砂。

對(duì)比度調(diào)節(jié)在低倍率的顯微鏡是類(lèi)似的程序，使用高倍率物鏡，如在圖4中示出。當(dāng)視場(chǎng)光闌是敞開(kāi)的（大于80％），標(biāo)本詳情被洗出，存在一個(gè)顯著量的散射和眩光。關(guān)閉視場(chǎng)光闌，50％和80％之間的位置，將產(chǎn)生最佳折中樣品的對(duì)比度和景深。低倍率為設(shè)計(jì)物鏡是簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)比他們更高的放大倍率。這是由于以較小的角度的照明產(chǎn)生的光錐由低倍率聚光鏡，需要較低的數(shù)值孔徑的聚光鏡。

測(cè)量光罩，它必須是在清晰對(duì)焦和疊加在檢體圖像，可以被插入到上面討論的幾個(gè)的共軛面。最常見(jiàn)的的目鏡（眼）測(cè)量和顯微攝影光罩被放置在中間像平面中，這是一個(gè)固定的孔徑光闌內(nèi)目鏡。這在理論上是可能的，也放置在試樣平面或在平面上的照明視場(chǎng)光闌的光罩。舞臺(tái)微米是專(zhuān)業(yè)的“光罩”放置于microslides，這是用來(lái)校準(zhǔn)目鏡分劃板，使樣品測(cè)量。從未做過(guò)名次光罩的平面中的視場(chǎng)光闌（就我們所知），就需要非常高的用于像差校正的聚光鏡完全消除工件和用于測(cè)量提供一個(gè)清晰的圖像。

彩色和中性密度過(guò)濾器經(jīng)常被安置的光學(xué)路徑內(nèi)，以減少光的強(qiáng)度和改變的顏色特性的照明。這些過(guò)濾器通常放在顯微鏡支架內(nèi)有幾個(gè)位置。一些現(xiàn)代化的實(shí)驗(yàn)室顯微鏡持有人之間夾燈住房和聚光透鏡，作為一個(gè)理想的位置，這些過(guò)濾器的過(guò)濾器。通常情況下，中性密度濾鏡的色彩校正過(guò)濾器和磨砂擴(kuò)散過(guò)濾器放在一起，在此過(guò)濾器的持有人。其他顯微鏡的設(shè)計(jì)提供了一組可以通過(guò)一個(gè)杠桿入光路切換到身體內(nèi)部構(gòu)建的過(guò)濾器。用于過(guò)濾器的第三個(gè)共同的位置保持器是一個(gè)安裝在底部的臺(tái)下聚光，明顯低于光闌的，將接受的明膠或玻璃過(guò)濾器。

重要的是不能將過(guò)濾器內(nèi)或附近的任何圖像形成的共軛平面，以避免在過(guò)濾器上的污垢或表面缺陷要成像與樣品一起。顯微鏡有一個(gè)附件，在底座附近的光端口的過(guò)濾器放置（附近的視場(chǎng)光闌）。這個(gè)位置可能是太接近視場(chǎng)光闌，表面污染可能是大家關(guān)注的焦點(diǎn)，或出現(xiàn)疊加到圖像的模糊文物。過(guò)濾器將直接在顯微鏡載物臺(tái)，出于同樣的原因，同樣也是不明智的。