透明細胞:徠卡顯微鏡的相襯觀察方法
相襯觀察法用來觀察無色透明或不染色的活體標本。因為人眼只對亮暗、顏色有識別能力。而這些無色透明的活體,除了折射率與周圍介質(zhì)不同而引起位相的不同外,其亮度與周圍介質(zhì)的亮度完全一樣。所以用普通的明場觀察無法察覺到這些透明體的存在。如下左圖表示光線透過上述的標本。
光與電磁波一樣也是以波動的形式存在。我們用一正弦波來描述,波峰值稱為振幅,它的平方值即代表亮度(能量)。
下圖中的“1”表示透過周圍介質(zhì)的正弦波?!?”表示光線透過標本時產(chǎn)生的衍射光,它的能量很弱(圖中已作了夸大修飾)?!?”是曲線“1”與曲線“3”迭加的波形。
因此,曲線“1”表示觀察背景光的亮度,曲線“2”表示標本成象的亮度。
可見曲線“1”與曲線“2”波形相同,僅僅位相不同而已,這就是明場觀察所得的效果。成象光與背景光同樣亮度,人眼無法察覺透明體的存在。
我們設(shè)法將直射光“1”的位相改變90°(超前或滯后),如下圖。直射光“1”與衍射光“3”位相差180°。那么,合成波形“2”與波形“1”相比振幅略有改變,但還不足以達到滿意的程度。
如果,我們設(shè)法將直射光“1”的能量衰減75%,如下圖。那么波形“2”將與橫坐標重合(為了識別,圖中作了夸大修飾),與波形“1”有明顯的差別。觀察的效果是,在較暗的背景下,看到黑色的透明體,這就是相襯觀察法。
因為相襯板的膜層厚度根據(jù)綠光(e 光)鍍制的,使用時應(yīng)用綠色濾光照明。
左圖為實現(xiàn)相襯觀察法的光學(xué)原理圖。
圖中:
1. 環(huán)形光闌 2. 聚光鏡 3. 物鏡 4. 相襯板
通過環(huán)形光闌的光束稱為直射光。環(huán)形光闌常位于聚光鏡的焦面上,光束經(jīng)聚光鏡后以傾斜的平行光束照明標本。再經(jīng)物鏡后,使環(huán)形光闌的象成在相襯板上。相襯板上鍍有改變位相及減弱光能的膜層,它也是環(huán)狀的,但其尺寸比環(huán)形光闌的象稍大。
相襯板的環(huán)形必須完全覆蓋環(huán)形光闌的象(允許偏心),見圖示。換句話說,也就是通過環(huán)形光闌的直射光,只能從環(huán)狀相襯板中通過,不允許從環(huán)狀相襯板外通過。
徠卡公司有簡易相襯裝置與標準相襯裝置之分。所謂簡易相襯裝置由普通聚光鏡環(huán)形光闌插板,相襯物鏡及綠色慮光片組成。不同倍率的相襯物鏡必須與不同的環(huán)形光闌配合使用。
相襯物鏡倍率 | 5 倍 | 10倍及20 倍 | 40倍 | 100 倍 |
環(huán)形光闌代號 | Ph0 | Ph1 | Ph2 | Ph3 |
未對中 對中良好
對簡易相襯裝置來說,由于產(chǎn)品離開公司前,環(huán)形光闌的中心與相襯環(huán)中心已校正好。因此,一般不再配校準環(huán)行光闌“對中望目鏡”。
標準相襯裝置由轉(zhuǎn)盤聚光鏡、相襯物鏡、綠色濾光片、對中望遠鏡及二個內(nèi)六角扳手組成。
轉(zhuǎn)盤聚光鏡通常帶有五個或六個園孔,內(nèi)置Ph0、Ph1、Ph2、Ph3 四種環(huán)形光闌,一個暗場環(huán)形光闌DF 和一個用于明場物鏡觀察的通孔。通過二個六角螺釘扳手,可以對環(huán)形光闌進行調(diào)中。對中目遠鏡插入目鏡管可以觀察到環(huán)形光闌圖像與環(huán)形相襯板對中狀況。
我們上面所介紹相襯圖像比背景光暗,稱為正相襯。反之,圖像比背景明亮稱為負相襯。
需要指出,相襯物鏡也可以作為普通的明場物鏡使用。只是由于能量分布的改變,以及雜散光的增加,圖像對比度稍遜一些。