熒光物質(zhì) ( 熒光染劑 ) 受到較短波長的光 ( 如 FITC : Ex:488 nm ) 及足夠的能量所激發(fā), 當(dāng)要回到穩(wěn)態(tài)的能階時, 會釋出較長波長的熒光 ( 如 FITC : Em : 515 nm ), 非熒光物質(zhì)則成為黑色的背景.

自體熒光 ( auto-fluorescence )又稱為主要熒光 ( primary fluorescence ), 是物質(zhì)本身無熒光染劑也能自體產(chǎn)生的熒光現(xiàn)象., 一般, 此種熒光會影響實(shí)際要觀察的樣品, 或者, 其自體熒光會干擾覆蓋實(shí)際要觀察的熒光, 讓我們無法真正的判定熒光產(chǎn)生的物質(zhì)及部位在那里? 所以, 利用特定的熒光染劑來表現(xiàn)特定的物質(zhì)與部位, 此種由染劑所釋出的熒光, 我們一般稱之為次級熒光 ( secondary fluorescence )

顯微鏡的熒光影像技術(shù)取決于下列主要因素 ( 除了顯微鏡本身光學(xué)系統(tǒng)的優(yōu)劣之外 ) :

1). 樣品處理

2). 熒光染劑 ( Fluorochrome = Fluorescent dye )

正確的選用熒光染劑, 必須將背景洗凈, 注意其熒光漂白時間, 也須留意其酸鹼值的變化.

新一代的染劑愈來愈多, 如 Multi-color GFP, DsRed, nanocrystal… etc. 在使用時, 必須特別注意所匹配的激發(fā)光源及感測的光譜范圍.熒光感測是仰賴感測光子的多寡. 愈多光子 ( Photon ), 熒光影像愈佳.

3). 激發(fā)光源 ( Light sources )

一般使用于熒光顯微鏡的激發(fā)光源有高壓汞燈及高壓氘燈

高壓汞燈 ( Hg 50 W – 使用交流電 及 Hg 100 W – 使用直流電 )

高壓汞燈Hg 50 W一般都用于綠色或藍(lán)色的光譜范圍. 然而, Hg 100W 能提供更為穩(wěn)定的

光源, 所提供的強(qiáng)度更為均勻., 較適宜光譜定量分析應(yīng)用.

高壓 Xenon燈 ( Xenon 75 W – 使用直流電)

高壓 Xenon燈能提供穩(wěn)定的電流, 在連續(xù)的可見光光譜范圍, Xenon燈提供較固定的光源平均強(qiáng)度.

所以, 一般都使用 Xenon燈于 UV, Violet 及其綠色或藍(lán)色的光譜范圍.

燈泡式的光源缺點(diǎn)之一即是 :

光源都是全光譜分布, 每一波長的光源, 其強(qiáng)度都不是恒定, 且能量較低也不均勻分布, 光

源強(qiáng)度也無法調(diào)整. 故, 樣品及染劑的應(yīng)用上, 頗難達(dá)到理想的控制.

共軛焦顯微鏡所采用的光源是雷射 ( Laser )., 波長純一, 高能量.

4). 熒光濾鏡 ( Fluorescence Filter Cube )

每一組熒光濾鏡基本上都包括了三個鏡片

1). 激發(fā)光濾鏡 ( Excitation Filter )

因為特定的染劑需要使用特定波長范圍的光來當(dāng)作激發(fā)光源 ( 才不致影響到其它不想要檢

視的物質(zhì)被激發(fā) ) 而一般燈泡式的光源 ( 如 Hg 50W, Hg 100W, Xe 75 W ), 所產(chǎn)生的光, 都含

蓋全波長 ( 300 – 1200 nm ) , 所以, 必須使用激發(fā)光濾鏡來篩選激發(fā)熒光染劑所須的光譜范圍

( 可為 Long-pass, Band-pass, Short-pass ). 激發(fā)光濾鏡是以特殊的鍍膜, 來產(chǎn)生可篩選波長的

功能. 例如 BP 450 – 490 nm, 即是僅讓 450 – 490 nm 間的光通過, 用以激發(fā) FITC 染劑.

2). 分光鏡 ( Dichromatic Mirror 或者 Beam Splitter )

將較短波長的激發(fā)光反射至樣品.

例如 RKP 510 nm, 即是, 510 nm 以下的光反射至樣品, 然而, 510 nm 以上的光可通過.

3). 釋放光濾鏡 ( Emission Filter 或者 Suppression Filter )

受檢樣品中的特定染劑及其它物質(zhì)被激發(fā)后, 所有被激發(fā)的物質(zhì)都釋放出來較長波長的螢

光, 然而熒光僅能在釋放光濾鏡所選定的特定波長范圍內(nèi)通過, 此通過的熒光即是我們所要

觀察的熒光影像.

例如 : LP 510 nm, 即是, 熒光光譜超過 510 nm 的, 都能通過濾鏡供觀察, 低于 510 nm 的螢

光則被阻擋看不到.

傳統(tǒng)的共軛焦顯微鏡所采用濾鏡轉(zhuǎn)盤 ( Filter wheel ), 其內(nèi)可安裝感測光濾鏡.

Leica TCS NT2 于每一個 PMT 前, 皆可安裝 1 組濾鏡飛輪, 每一個飛輪可安裝最多達(dá) 7 個

的濾鏡.

Leica TCS SP 則是以連續(xù)式的全波長分光光譜系統(tǒng)來取代傳統(tǒng)的濾鏡, 因為, 有限的濾鏡無

法滿足染劑的應(yīng)用, 更無法滿足新一代染劑的使用. 使用可全波長感測的分光光譜系統(tǒng), 可

無限制的自訂各種感測光譜, 有如一組無限的濾鏡. 真正達(dá)到多工多用途與多使用者的目的.

5). 光學(xué)鏡頭解析

鏡頭的解析, 是熒光影像質(zhì)量的重要影響因素之一, 基本上, PL-Fluotar 及 PL-APO 級的油鏡能提供較好的光學(xué)穿透率., 其中, 又以較高 NA 值 ( NA 值與鏡頭開口角度 α 成正比 ) 的鏡頭為好. ( 鏡頭必須使用折射率 n= 1.518 immersion oil, 一般鏡頭解析計算, R = n˙ sinα ), 如 : PL-APO 63x/1.32 Oil, PL-APO 100x/1.40 Oil

同樣 100x 鏡頭, 如果使用次一級的 N Plan 100x/1.25 Oil, 則因其 NA 較小, 色差與像差的修正都略遜于 PL-APO 100x/1.40 Oil鏡頭, 故, 熒光影像質(zhì)量較差., 在低強(qiáng)度的熒光影像鏡檢, 表現(xiàn)更是明顯.

所以, 熒光影像所使用的光學(xué)鏡頭依序考量應(yīng)為 PL-APO, PL-Fluotar, N Plan, C Plan, Achromatic.

共軛焦顯微鏡建議使用專屬的鏡頭, 其于 R, G, B, 各作有特別的修正 ( correction ), 能提供最高的光學(xué)穿透與解析 ( Point-spread resolution ). 故, 其有別于一般鏡頭.

例如 : PL-APO 63x/1.32 CS Oil ( 有 CS 標(biāo)示, 即代表 Confocal System 專屬鏡頭 )

6). 熒光傳感器

基本上, 一般除了利用目鏡 ( Eyepiece ) 檢視之外, 絕大部份都使用相機(jī) ( Camera ) 或 CCD 攝影機(jī) 來擷取熒光影像.

由于熒光影像一般都較弱, 故照相時, 依照熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱分布, 可能必須使用俱有點(diǎn)測光 ( Spot metering ) 及 俱有長時間曝光的照相系統(tǒng)為考慮因素., 然而, CCD 攝影機(jī)則以大芯片 ( CCD Chip ), 冷卻式 ( Cooled ), 對極低弱的光有較靈敏感應(yīng)的黑白 CCD 攝影機(jī)為考慮因素. 

使用黑白 CCD 攝影機(jī)的原因之一是其比一般彩色 CCD 攝影機(jī)感光較為靈敏, 顯像解析較高.

如要取得彩色熒光影像, 則可通過影像擷取卡 ( Frame Grabber ) 取像, 以數(shù)位影像方式, 利用軟件作 RGB 三原色套色即可 ( 一般, 利用 Photoshop 軟件, 即可處理彩色套色 ). 如要直接擷取實(shí)彩色熒光影像 ( True Color Image ), 則可加裝 RGB-濾鏡 即可.