奧林巴斯熒光顯微鏡使用方法
2020-09-04 09:35:28
這里將以?shī)W林巴斯BX53和BX43熒光顯微鏡為例，來(lái)做分析。
System Microscope BX53
奧林巴斯和尼康的三波段激發(fā)的熒光濾光片組合包括兩個(gè)很精確的平衡組合(DAPI-FITC-TRITC和DAPI-FITC-Texas Red)，每個(gè)組合包括三個(gè)帶通的發(fā)射區(qū)域，可以選擇性的通過(guò)藍(lán)色、綠色、黃色、橙色和紅色光譜區(qū)的激發(fā)光。這樣的相互輔助作用就可以探究激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片光譜以及多色反光鏡的激發(fā)和發(fā)射濾光片的改變(為在紫外、藍(lán)光和綠光區(qū)的多色熒光標(biāo)記設(shè)計(jì)的三波段激發(fā)光組合)是如何影響信號(hào)級(jí)別、光譜交叉、整體濾光性能和圖像對(duì)比度的。
DAPI-FITC-TRITC–這個(gè)濾光片組合的設(shè)計(jì)是用來(lái)同時(shí)檢測(cè)DAPI, FITC和TRITC或者其他具有相似光譜的熒光探針。三個(gè)窄帶激發(fā)和發(fā)射波段是紫外激發(fā)光的特定區(qū)和相對(duì)應(yīng)的藍(lán)色發(fā)射光，藍(lán)色激發(fā)光對(duì)應(yīng)的綠色發(fā)射光，以及綠色激發(fā)光和相對(duì)應(yīng)的橙色-紅色發(fā)射光。
DAPI-FITC-Texas Red–與標(biāo)準(zhǔn)的DAPI-FITC-TRITC組合相比，這個(gè)濾光片組合的設(shè)計(jì)初衷是為了觀察紫外激發(fā)-藍(lán)色發(fā)射的帶通區(qū)，和藍(lán)色激發(fā)-綠色發(fā)射的帶通區(qū)之間的細(xì)微變化。這個(gè)設(shè)計(jì)是為了更好的與Texas Red所需的更大的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)結(jié)合。多帶通區(qū)域提供了*佳的探測(cè)條件，*小的光譜交叉和噪聲，可以同時(shí)觀察DAPI, FITC和Texas Red，或者具有相似波長(zhǎng)的熒光探針組合。
奧林巴斯熒光顯微鏡使用方法
首先是隨即選擇的熒光標(biāo)本出現(xiàn)在Specimen Image窗口，同時(shí)紫外-藍(lán)光-綠光的三帶通激發(fā)光濾光片組合(DAPI-FITC-TRITC)的光譜特征顯示在“濾光片組合”(Filter Set Spectral Profiles)欄下。通過(guò)選擇在“光譜交叉部分”(Spectral Cross Sections)下合適的check box(Absorption或Emission)，熒光的吸收和發(fā)射光譜交叉的部分(濾光片投射帶通的重疊部分)就可以單一或者一起觀察了。當(dāng)一個(gè)或者多個(gè)check box被激活時(shí)，組合的濾光片傳送和發(fā)射光譜會(huì)附加在用于標(biāo)本熒光觀察的吸收和發(fā)射光譜(不包括自發(fā)熒光的植物標(biāo)本)上。熒光吸收光譜在輔助區(qū)時(shí)用褐色填充的，而在相應(yīng)的發(fā)射光光譜區(qū)用灰色填充的。濾光片組合的波長(zhǎng)特征以較低的位置展示在黑色的長(zhǎng)方形box內(nèi)。這些數(shù)值常常根據(jù)滑塊從左到右轉(zhuǎn)換而更新。
為了操作這個(gè)輔助部分，使用Filter Set滑塊可以將三帶寬激發(fā)的兩個(gè)濾光片組合相互轉(zhuǎn)換。因?yàn)榛瑝K是由左至右滑動(dòng)的，所以激發(fā)光和阻擋濾光片以及多色反光鏡的光譜會(huì)同時(shí)轉(zhuǎn)換。值得注意的是，持續(xù)轉(zhuǎn)換光譜并不意味著任何的濾光片組合都是可能的，也不意味單一的濾光片組合的光譜可以隨意改變。在選擇的濾光片組合中改變光譜范圍很簡(jiǎn)單，有助于在每一個(gè)光學(xué)模塊中的濾光片組合建立聯(lián)系。
單一的濾光光譜(激發(fā)光，發(fā)射光和多色反光鏡)可以通過(guò)選擇和去除Filter Set Spectral Profiles下相應(yīng)的check box來(lái)添加和刪除。除此之外，熒光的吸收和發(fā)射光譜可以通過(guò)同樣的操作添加和刪除(Spectral Cross Sections)。觀察樣本的圖像會(huì)隨著濾光片的轉(zhuǎn)換而改變，反應(yīng)出信號(hào)強(qiáng)度和對(duì)比度的變化;而這種變化是由滑塊移動(dòng)引起濾光片組合產(chǎn)生的。一個(gè)新的目標(biāo)樣本可以通過(guò)Choose A Specimen的下拉菜單隨時(shí)進(jìn)行，而用于觀察的熒光種類就列在下拉菜單中。在任何情況下，樣本都經(jīng)過(guò)兩種或者多種熒光探針的染色，通過(guò)選擇的寬窄的帶通阻擋濾光片組合來(lái)觀察。
奧林巴斯熒光顯微鏡詳細(xì)介紹
奧林巴斯和尼康的三波段熒光組合主要是為特定的三色熒光組合觀察而設(shè)計(jì)的，而且他們?cè)谙嗨频奈蘸桶l(fā)射光譜的其他探針組合中同樣有效的觀察。利用精確的波段選擇，和在反射與傳遞區(qū)的極速轉(zhuǎn)換，多種的激發(fā)和發(fā)射信號(hào)可以在*低的干涉條件下區(qū)分開(kāi)來(lái)。為了保持三個(gè)不同熒光信號(hào)波段的穩(wěn)定性，這些特制的濾光片組合也可以將多帶通特性和多色反光鏡結(jié)合，這樣與特定激發(fā)和發(fā)射濾光片互補(bǔ)的傳遞和發(fā)射區(qū)就可以使用了。每一個(gè)尼康的三波段熒光組合都為DAPI、FITC和TRITC優(yōu)化設(shè)計(jì)。與這些熒光組合的相關(guān)光譜區(qū)的范圍由紫外激發(fā)和藍(lán)光發(fā)射到綠光激發(fā)和紅光發(fā)色區(qū)域。
奧林巴斯和尼康DAPI-FITC-TRITC的三波段濾光片組合一個(gè)為紫外區(qū)域激發(fā)光(385到400nm)設(shè)計(jì)的激發(fā)濾光片結(jié)合，這個(gè)激發(fā)光濾光片伴有一個(gè)帶通發(fā)射濾光片在它*初的信號(hào)波段內(nèi)傳遞藍(lán)色熒光(450到465nm)。這個(gè)濾光片的第二個(gè)激發(fā)-發(fā)射波長(zhǎng)組合使藍(lán)光在475-490nm這么窄的波長(zhǎng)范圍內(nèi)激發(fā)，在505-535nm探測(cè)到綠色熒光。第三個(gè)熒光信號(hào)由綠光區(qū)域激發(fā)光產(chǎn)生(5450-565nm)，這可以引起橙色-紅色光發(fā)射，探測(cè)到580-620nm的波長(zhǎng)。這個(gè)組合的三色熒光波段可以同時(shí)優(yōu)化DAPI, FITC和RITC組合。尤其是對(duì)不同的細(xì)胞成分觀察時(shí);DAPI, FITC, and TRITC的熒光組合也適合這個(gè)濾光片組合使用，這是因?yàn)锳lexa Fluor 488和MitoTracker Red CMXRos的光譜特性與FITC和RITC的光譜特性相似的緣故。
在三色激發(fā)模塊中，與在其他的多波段組合一樣，多色反光鏡的設(shè)計(jì)原則是以分開(kāi)不同熒光信號(hào)為基礎(chǔ)的，還可以檢測(cè)到*小的光譜交叉(spectral bleedthrough)和噪聲。與長(zhǎng)分光光束器常用于傳統(tǒng)的濾光片組合相反的是，多波段組合中使用有幾個(gè)帶通的區(qū)域的多色反光鏡。典型的是，*個(gè)反光鏡的cut-on波長(zhǎng)值就在短波長(zhǎng)激發(fā)光峰值上幾納米處，接著是極速的cut-off，這樣可以允許第二個(gè)激發(fā)波段通過(guò)。在三波段濾光片組合中，這個(gè)傳遞-反光模式可以在第三個(gè)信號(hào)通道中再次重復(fù)。在DAPI-FITC-TRITC模式中使用的二色反光鏡有多帶通傳遞區(qū)域。這些cut-on的波長(zhǎng)位于435, 500和570nm。
在多波段濾光片組合中應(yīng)用薄片干涉技術(shù)的應(yīng)用使各熒光信號(hào)水平得到平衡，這樣可以得到*佳的成像效果。在很多濾光片組合中，短波長(zhǎng)激發(fā)峰值的傳遞會(huì)降低以平衡兩個(gè)或者三個(gè)發(fā)射信號(hào)，還可以是光漂白和對(duì)樣本的毒害降到*低。這一點(diǎn)在為在紫外光譜區(qū)有單一熒光激發(fā)設(shè)計(jì)的濾光片組合中尤為重要，因?yàn)樗梢允馆^短波長(zhǎng)獲得高的激發(fā)效率。短波長(zhǎng)激發(fā)峰的密度的顯著下降在尼康三波段組合中的傳遞光譜區(qū)域均有體現(xiàn);也可以通過(guò)檢測(cè)濾光片組合傳遞光譜區(qū)域獲得同樣的結(jié)果。舉例來(lái)講，雙波段的FITC-Texas Red和三波段的DAPI-FITC-Texas Red組合利用同樣的雙色反光鏡和發(fā)射光濾光片，僅僅在激發(fā)光濾光片部分有差別，在這兩組濾光片組合中第三個(gè)短波帶通添加到DAPI激發(fā)模式下。
要想同時(shí)檢測(cè)DAPI, FITC和Texas Red(或相似譜區(qū)的熒光)，利用DAPI-FITC-Texas Red三激發(fā)波段濾光片組合很容易的觀察到。紫外激發(fā)、藍(lán)色發(fā)射光濾光片波段和藍(lán)色激發(fā)、綠色發(fā)射波段(分別對(duì)應(yīng)于DAPI和FITC)與DAPI-FITC-TRITC組合有類似的特性，但是與TRITC相比，它們的綠色激發(fā)紅色發(fā)射在更長(zhǎng)的波段發(fā)生。這個(gè)組合中使用的激發(fā)濾光片一個(gè)帶通區(qū)為395-410nm，發(fā)射濾光片的帶通區(qū)為450-470nm，這些波段適宜DAPI和相似熒光基團(tuán)觀察中使用。第二個(gè)波段的激發(fā)光在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍490-505nm，檢測(cè)對(duì)應(yīng)的綠光發(fā)射范圍在515-545nm(用于FITC及相似熒光基團(tuán)觀察)。Texas Red熒光的信號(hào)通道*佳的激發(fā)光范圍在560-580nm，發(fā)射波段是在紅光區(qū)域的600-650nm處。
雖然DAPI, FITC和Texas Red的三波段組合已經(jīng)達(dá)到*佳，但是形同的吸收和發(fā)射光譜特性的熒光探針也可以用這個(gè)濾光片組合觀察。跟DAPI-FITC-Texas Red 模塊相比，DAPI-FITC-TRITC模塊，具有紅色發(fā)射光帶通可以在較短波長(zhǎng)觀察情況下調(diào)整15nm，產(chǎn)生的圖像顏色更偏橙色。DAPI-FITC-Texas Re濾光片組合中的雙色反光鏡(分束器)的帶通區(qū)根據(jù)激發(fā)和發(fā)射光濾光片的窗口在445，510和590nm時(shí)定位。