我們?nèi)绾味x“熒光”？

在任何搜索引擎中鍵入“熒光的定義”這個(gè)短語，你會(huì)得到如下的短語或者非常相似的東西;

“由于X射線或紫外線等波長較短的入射輻射，某些物質(zhì)發(fā)出的可見或不可見輻射。”

這個(gè)定義如何與熒光顯微鏡相關(guān)（圖1）“較短波長的入射輻射？”僅僅是用來“激發(fā)”樣本中的熒光團(tuán)的光源。這種光可以包括可見光譜，紫外線（UV）和紅外線（IR），顯微鏡中的光源可以從汞燈或氙弧燈到激光器。所述的熒光團(tuán)（“某些物質(zhì)”在上述的定義）是具有特殊性能，由此它們可以由具有較低波長的光激發(fā)后再發(fā)射更高波長的光/光子的化學(xué)化合物。

圖1：通過熒光顯微鏡觀察熒光標(biāo)記的細(xì)胞。

波長的基本單位是儀表，“波長”定義為光波的兩個(gè)連續(xù)波峰或波谷之間的距離。波長的符號(hào)是希臘字母lambda（l）。在顯微鏡中通常使用的波長在400-700nm之間的可見光譜范圍內(nèi)的納米（nm）范圍內(nèi)，在400nm以下的UV光譜和在700nm開始的IR光譜（圖2）。

熒光團(tuán)按其激發(fā)和發(fā)射波長分類，通常以顯示最大峰值的圖形的形式存在。熒光基團(tuán)在所謂的“基態(tài)”中是天然穩(wěn)定的。當(dāng)它們吸收光子（來自“較短波長”的光）時(shí)，光子的能量將熒光團(tuán)的電子升高到更高能量的“激發(fā)”狀態(tài)。被激發(fā)的電子不會(huì)保持這種狀態(tài)，而是在返回到基態(tài)時(shí)失去振動(dòng)能量并發(fā)射更長波長的光子。對(duì)于顯微鏡中使用的熒光團(tuán)，從激發(fā)到返回到地的一個(gè)完整周期占據(jù)0.5到20納秒的區(qū)域。

熒光團(tuán)激發(fā)和發(fā)射波長通?？s寫為帶有下標(biāo)“ex”（激發(fā)）或“em”（發(fā)射; l_ex或l_em）的希臘字母λ 。

每個(gè)熒光團(tuán)都具有不同的最大激發(fā)和發(fā)射光譜，并且該屬性用于區(qū)分相同樣本中的不同物鏡。例如，使用熒光染料DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）來突出細(xì)胞中的核蛋白以及熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽以突出顯示肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。

熒光的Jablonski圖

波蘭物理學(xué)家亞歷山大·賈布朗斯基教授（Aleksander Jablonski，1898-1980年）是第一個(gè)用三級(jí)能量圖來描述地面/激發(fā)/發(fā)射之間的循環(huán)的方法，簡稱為“雅布倫斯基圖”。1930年，他在華沙大學(xué)獲得博士學(xué)位，主題為“論激發(fā)光波長變化對(duì)熒光光譜的影響”。1933年，他發(fā)表了他的論文（“染料中的反斯托克斯熒光的效率”），其中包含了Jablonski圖。熒光團(tuán)行為的這種簡單而有效的說明突出顯示了從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的激發(fā)以及隨著更長波長的光子的發(fā)射而回到地面（圖3）。

圖3：熒光Jablonski圖。熒光團(tuán)可以吸收光子。光子的能量將熒光團(tuán)的電子升高到更高能量的“激發(fā)”狀態(tài)。隨后，被激發(fā)的電子在返回到基態(tài)時(shí)失去振動(dòng)能量并發(fā)射更長波長的光子。

雖然圖3是一個(gè)簡化的Jablonski圖，但應(yīng)該指出，熒光團(tuán)可以存在于許多不同的激發(fā)和發(fā)射狀態(tài)。此外，取決于分子的電子自旋，熒光團(tuán)可以經(jīng)由稱為“ 三重態(tài) ”的不同放松狀態(tài)返回到地面。

斯托克斯位移

喬治·加布里埃爾·斯托克斯爵士（George Gabriel Stokes，1819-1903）是愛爾蘭的數(shù)學(xué)家和物理學(xué)家，在他一生中，他在光學(xué)和光學(xué)領(lǐng)域取得了許多發(fā)現(xiàn)和進(jìn)展。他于1849年被任命為劍橋彭布羅克學(xué)院的盧卡遜數(shù)學(xué)教授，直到1903年去世。他寫了一篇精美的描述性文章，于1852年出版，名為“關(guān)于光的可變性的變化”。本文中使用的語言不同于我們?cè)诂F(xiàn)代科學(xué)文獻(xiàn)中使用的語言。以下是斯托克斯使用的精彩語言的兩個(gè)簡短摘錄。

“到了去年秋天，當(dāng)季節(jié)的晚些時(shí)候提供了很少的觀察的機(jī)會(huì)，我從不同的來源得知，那種已經(jīng)被提及的具有如此高程度的內(nèi)部分散性的黃色玻璃是用鈾的氧化物著色“。

和：

“看到管子一下子變成了無形的光芒，它真的是一個(gè)奇怪的景象：它實(shí)際上是黑暗可見的，總而言之，這種現(xiàn)象有一種神秘的外觀。

“斯托克斯位移”后來被命名為他的榮譽(yù)。當(dāng)激發(fā)的電子返回到基態(tài)并發(fā)射光子時(shí)，波長總是比用于激發(fā)熒光團(tuán)的波長更長。這是由于波長與輻射能量成反比的光的特性。斯托克斯位移描述峰值激發(fā)和熒光團(tuán)的峰值發(fā)射波長（圖4）之間的差值（單位為納米）。 

隨著斯托克斯位移的增加，區(qū)分熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射成比例地更容易。熒光團(tuán)在斯托克斯位移方面具有獨(dú)特的特征，這是由于它們的電子構(gòu)型和分子結(jié)構(gòu)。

綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)和使用

斯托克斯首先用“熒光”這個(gè)詞來形容他所觀察到的現(xiàn)象，但是這個(gè)歷史可以追溯到1565年。西班牙的一位醫(yī)生和植物學(xué)家尼古拉斯·蒙那德（Nicolas Monardes）描述了一種奇怪的藍(lán)色，腎臟。盡管有這些早期的觀察，但是在400年后的今天，一種綠色熒光物質(zhì)被報(bào)道在一個(gè)活的有機(jī)體中。在1955年Davenport和尼科爾發(fā)表的一篇論文  描述水母稱為類的子類的嗜酸性粒細(xì)胞的組織上相水螅。當(dāng)時(shí)，這項(xiàng)工作的作者并沒有意識(shí)到嗜酸性粒細(xì)胞含有綠色熒光蛋白（GFP）。

直到1962年，小森下村（* 1928）發(fā)表了一篇文章 ，其中相關(guān)成分被認(rèn)為是一種蛋白質(zhì)。與他在普林斯頓大學(xué)的教授（Frank Johnson）一起，他們從生物發(fā)光水母Aequorea victoria收集樣品。他們有獨(dú)特的方法從熒光蛋白中分離熒光蛋白，即通過棉布袋擠壓孤立的生物發(fā)光組織，產(chǎn)生下村被稱為“擠壓”的溶液。

1994年，哥倫比亞大學(xué)的Martin Chalfie（* 1947）教授編寫了一篇論文，證明編碼GFP的基因可以在原核和真核細(xì)胞（即大腸桿菌和秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)元）中功能性表達(dá)。該論文指出：“因?yàn)檫@種熒光不需要外源底物和輔因子，所以GFP的表達(dá)可以用來監(jiān)測(cè)活體中的基因表達(dá)和蛋白定位。正是這一出版物為廣泛使用GFP在生物學(xué)研究上鋪平了道路。

圖5：C.elegans，GFP在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)

一年之后，圣地亞哥Califronia大學(xué)的Roger Tsien教授（1952-2016）（曾研究野生型GFP的突變體）在自然界的科學(xué)通信中發(fā)表了他的研究成果。Tsien及其同事選擇了這種單點(diǎn)突變（S65T）的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)樗哂凶铋L的激發(fā)和發(fā)射波長（490/510nm），使其更具光穩(wěn)定性，并導(dǎo)致眾所周知的GFP激發(fā)/發(fā)射峰。

2008年，Shimomura，Tsien和Chalfie共同獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，他們的角色和發(fā)現(xiàn)GFP。當(dāng)Shimomura做了他的諾貝爾演講時(shí)，他說：“當(dāng)我在1979年發(fā)現(xiàn)GFP的發(fā)色團(tuán)時(shí)，我認(rèn)為我已經(jīng)盡了我所能做的所有GFP，并決定終止我在GFP上的工作，以便集中精力去研究生物發(fā)光”。他繼續(xù)承認(rèn)：“綠色熒光蛋白是一種美麗的蛋白質(zhì)，但在發(fā)現(xiàn)后的30年內(nèi)，它仍然沒有用?！?/span>

自從Tsien的發(fā)現(xiàn)以來，他的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了許多GFP變體，覆蓋了很多可見光譜，并且確實(shí)革新了光學(xué)顯微鏡和成像領(lǐng)域。由于這樣的基因工程，GFP的顏色范圍從藍(lán)色部分（EBFP; 380/460 nm）到黃色部分（YFP; 514/527 nm）。 

探針

與成像領(lǐng)域一樣，熒光團(tuán)可以用作“記者”來研究細(xì)胞和生物體中的基因表達(dá)。酶螢光素酶以及編碼GFP的基因是通常用于檢查特定基因是否由細(xì)胞表達(dá)的那些。用遺傳修飾的病毒DNA或在靶基因表達(dá)時(shí)發(fā)熒光的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生物體或細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)的感興趣的細(xì)胞器或部位可以在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中可視化和檢查。

用熒光團(tuán)標(biāo)記（或“標(biāo)記”）的抗體通常稱為“ 熒光探針 ”。在廣泛使用GFP和發(fā)現(xiàn)之后的其他熒光團(tuán)之前，兩種最常用的標(biāo)記抗體的熒光團(tuán)是FITC（異硫氰酸熒光素）和TRITC（四甲基羅丹明異硫氰酸酯）。盡管FITC和TRITC仍在使用，但是在這一領(lǐng)域已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，熒光團(tuán)和探針的選擇至少是非常廣泛的。

當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)室中使用最廣泛的熒光團(tuán)之一是“Alexa Fluor”染料?？捎玫腁lexa Fluor染料的當(dāng)前范圍跨越可見光譜范圍從346到784 nm的激發(fā)波長。 

量子點(diǎn)

量子點(diǎn)（或“Qdots”）是1981年由俄羅斯科學(xué)家阿列克謝·?；颍ˋlexey Ekimov）在玻璃矩陣中首次發(fā)現(xiàn)的，同時(shí)在圣彼得堡的瓦維洛夫州立光學(xué)研究所（Vavilov State Optical Institute）工作。然而，量子點(diǎn)的第一個(gè)膠體溶液是由位于新澤西州AT＆T貝爾實(shí)驗(yàn)室從事半導(dǎo)體工作的Louis Brus發(fā)現(xiàn)的。他現(xiàn)在是哥倫比亞大學(xué)化學(xué)教授。在1983年和1984年發(fā)表的兩篇論文中，Brus描述Qdots為“小型半導(dǎo)體微晶”。

量子點(diǎn)表現(xiàn)出獨(dú)特的方式 - 盡管它們含有少至100到100000個(gè)原子，但它們表現(xiàn)出的性質(zhì)好像是由單個(gè)原子組成的。但是，它們確實(shí)符合熒光團(tuán)的性質(zhì)，從而它們能夠吸收光能，在返回基態(tài)時(shí)被激發(fā)并釋放出光子的光子。但是它們發(fā)射的光的波長取決于Q點(diǎn)的尺寸，Q點(diǎn)越小，發(fā)射波長越短。這個(gè)性質(zhì)是由于更小的Qdots具有更大的“最小帶隙”。這是激發(fā)電子到更高能態(tài)所需的能量的量。由于較小的量子點(diǎn)需要更多能量用于激發(fā)，所以隨后發(fā)射更低波長的光（波長與激發(fā)能量成反比）。

幾乎是20年后的2002年，Qdots成為加利福尼亞Quantum Dot Corporation的生命科學(xué)研究人員的商業(yè)化產(chǎn)品。

量子點(diǎn)是用于熒光應(yīng)用的非常明亮和穩(wěn)定的工具。研究表明，量子點(diǎn)比傳統(tǒng)熒光團(tuán)亮幾個(gè)數(shù)量級(jí)，盡管與有機(jī)染料相比，它們的亮度有一些變化。在光穩(wěn)定性方面，量子點(diǎn)報(bào)道比傳統(tǒng)熒光團(tuán)穩(wěn)定多達(dá)100倍，在一次體內(nèi)成像研究中，它們?nèi)员３譄晒忾L達(dá)四個(gè)月。

在常規(guī)熒光探針中，一個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)可以連接到單個(gè)感興趣的抗體。然而，由于Qdots的表面積非常大，許多分子和抗體可以附著到單個(gè)點(diǎn)上，這可能具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括熒光信號(hào)放大。量子點(diǎn)的使用也提供了多重檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，在多重檢測(cè)中可以同時(shí)對(duì)多種波長進(jìn)行成像。在這樣的測(cè)定中，唯一的變量是由研究人員選擇的Qdot的大?。ㄒ约耙虼说陌l(fā)射波長）?？梢允褂冒坠馔瑫r(shí)進(jìn)行大量Q點(diǎn)的激發(fā)，否則會(huì)使用多個(gè)激光器并進(jìn)行許多調(diào)整以形成最終圖像。