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徠卡顯微鏡入射光熒光顯微鏡里程碑

2020-09-03 14:11:58

落射熒光顯微鏡

約翰·塞巴斯蒂安·普洛姆1927年出生在薩瓦倫托(蘇門答臘),是一名荷蘭煤礦工程師的兒子。在幼年時(shí)期,他和父母一起回到了荷蘭,在那里他創(chuàng)作了繪畫作為他的激情之一。高中畢業(yè)后,他發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)迷人的色彩領(lǐng)域,我們將在稍后學(xué)習(xí)。普洛姆決定學(xué)習(xí)醫(yī)學(xué),并在烏得勒支,哈佛和阿姆斯特丹接受教育。之后他在邁阿密和阿姆斯特丹大學(xué)工作,之后被提升為荷蘭萊頓醫(yī)學(xué)院的教授。

在他的研究活動(dòng)中,他發(fā)現(xiàn)熒光顯微鏡是一個(gè)**的工具。在20世紀(jì)60年代,特殊類型的標(biāo)本照明開始流行起來(lái),事實(shí)上,早在1925年,Policard和Paillot就已經(jīng)知道了這種照明,他們對(duì)絲蟲的自發(fā)熒光事件感興趣(Policard and Paillot,1925)。一些研究人員重新啟動(dòng)了兩名法國(guó)科學(xué)家的項(xiàng)目,將熒光照明和樣品檢測(cè)放在顯微鏡的同一側(cè)。這種使用入射光的原理被稱為“落射照明”“與透射顯微鏡相反。使用這種技術(shù)用于熒光顯微鏡的一大優(yōu)點(diǎn)是避免檢測(cè)由光源傳送的發(fā)射光(圖1)。另一個(gè)好處是具有更多的機(jī)械特性:在透射照明中,聚光鏡和物鏡有兩個(gè)分開的光軸,必須仔細(xì)對(duì)準(zhǔn)。在落射照明中,物鏡是:聚光鏡和光收集物鏡。像這樣,可以避免對(duì)齊問(wèn)題。



圖1:熒光顯微鏡中epi-照明的好處:在透射照明(左)的情況下,光源和圖像檢測(cè)位于目標(biāo)的相反側(cè)。 使用這種設(shè)置,一個(gè)明顯的限制是激發(fā)光(淺藍(lán)色)的不必要的檢測(cè)。 相比之下,Epi-Illumination(右圖)使用照明目標(biāo)以及圖像檢測(cè)。 對(duì)于熒光顯微鏡來(lái)說(shuō),這意味著用戶不會(huì)暴露于激發(fā)光。

圖1:熒光顯微鏡中epi-照明的好處:在透射照明(左)的情況下,光源和圖像檢測(cè)位于目標(biāo)的相反側(cè)。使用這種設(shè)置,一個(gè)明顯的限制是激發(fā)光(淺藍(lán)色)的不必要的檢測(cè)。相比之下,Epi-Illumination(右圖)使用照明目標(biāo)以及圖像檢測(cè)。對(duì)于熒光顯微鏡來(lái)說(shuō),這意味著用戶不會(huì)暴露于激發(fā)光。



分色光束分光鏡

幾年前蘇聯(lián)的兩位研究人員已經(jīng)提供了熒光落射照明顯微鏡的一個(gè)非常重要的輸入。Brumberg和Krylova開發(fā)了一種用于入射光紫外激發(fā)的所謂二色分光鏡(Brumberg and Krylova,1952)。二色性材料能夠讓某一波長(zhǎng)范圍的光線通過(guò),而其他波長(zhǎng)的光線則被反射(圖2)。 

這個(gè)原理對(duì)于熒光落射照明是不可或缺的,因?yàn)榧ぐl(fā)光必須以某種方式融合到顯微鏡的光路中(圖3)。更確切地說(shuō),二向色分束器對(duì)于來(lái)自光源的期望的激發(fā)光的波長(zhǎng)是不可穿透的并且將激發(fā)光反射到樣本。來(lái)自樣本的熒光又可以將二向色分束器傳送到檢測(cè)側(cè)。



圖2:透射圖說(shuō)明了二向色分束器的功能。 反射較短波長(zhǎng)的光(藍(lán)色箭頭),較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光(紅色箭頭)可以通過(guò)濾波器。

圖2:透射圖說(shuō)明了二向色分束器的功能。反射較短波長(zhǎng)的光(藍(lán)色箭頭),較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光(紅色箭頭)可以通過(guò)濾波器。

圖3:熒光落射照明需要能夠?qū)⒓ぐl(fā)光(藍(lán)色)反射到樣品并將發(fā)射光(綠色)傳遞到檢測(cè)側(cè)的分色鏡(灰色)。 激發(fā)光的波長(zhǎng)可以用相應(yīng)的濾光片(橙色)預(yù)選。 面向檢測(cè)側(cè)(紫色)的過(guò)濾器專門使熒光團(tuán)的波長(zhǎng)通過(guò),并排除來(lái)自激發(fā)的剩余雜散光。

圖3:熒光落射照明需要能夠?qū)⒓ぐl(fā)光(藍(lán)色)反射到樣品并將發(fā)射光(綠色)傳遞到檢測(cè)側(cè)的分色鏡(灰色)。激發(fā)光的波長(zhǎng)可以用相應(yīng)的濾光片(橙色)預(yù)選。面向檢測(cè)側(cè)(紫色)的過(guò)濾器專門使熒光團(tuán)的波長(zhǎng)通過(guò),并排除來(lái)自激發(fā)的剩余雜散光。



不幸的是,由于鐵幕之間缺乏信息交流,普洛姆不知道俄羅斯的發(fā)展。盡管如此,他自己也開始使用二色分光鏡。在Ploem的特殊情況下,他和著名的特種玻璃Schott(美因茨)生產(chǎn)商一起開發(fā)了一種分光鏡,它反映了藍(lán)光和綠光(Ploem,1965)。之后,他用Leitz公司提供的中性分束器修改了一個(gè)“Opak”落射照明器,通過(guò)引入一個(gè)帶有四個(gè)不同二向色分束器的滑塊,他可以實(shí)現(xiàn)紫外,紫光,藍(lán)色和綠色(Ploem,1967)(圖4)。



圖4:帶有四個(gè)分色器的熒光多波長(zhǎng)落射照明器,安裝在滑塊上,用于紫外,紫色,藍(lán)色和綠色激發(fā)光的入射照明。 修建在阿姆斯特丹大學(xué)(1965年,Ploem)。

圖4:帶有四個(gè)分色器的熒光多波長(zhǎng)落射照明器,安裝在滑塊上,用于紫外,紫色,藍(lán)色和綠色激發(fā)光的入射照明。修建在阿姆斯特丹大學(xué)(1965年,Ploem)。




熒光濾光激發(fā)塊

二向色分束器的發(fā)展以產(chǎn)生具有離散波長(zhǎng)的激發(fā)光具有重要的優(yōu)點(diǎn)。紫外光譜(?100nm?380nm)的激發(fā)在當(dāng)時(shí)是非常普遍的,但具有惱人的副作用:自發(fā)熒光。許多組織物質(zhì)被紫外光激發(fā),導(dǎo)致微弱的背景發(fā)光(圖5)。通過(guò)將分色鏡的反射波長(zhǎng)擬合到綠色或藍(lán)色范圍,Ploem能夠達(dá)到在那些時(shí)間非常普遍使用的兩種熒光染料FITC(494nm )和TRITC(541nm)的激發(fā)*大值,而沒(méi)有產(chǎn)生自發(fā)熒光。FITC(熒光素異硫氰酸酯)和TRITC(四甲基羅丹明-5-(和6) - 異硫氰酸酯)可以與抗體偶聯(lián),并仍然用于免疫熒光顯微術(shù)。通過(guò)在很小的范圍內(nèi)激發(fā)它們的*大值,組織標(biāo)本的對(duì)比度顯著增強(qiáng)(圖5)。用Ploem的二向色分光鏡產(chǎn)生的激發(fā)光束如此有效地?cái)M合到FITC的激發(fā)*大值,甚至可以使用具有相當(dāng)差的發(fā)射光譜的光源。



圖5:左側(cè):用寬帶UV激發(fā)照射標(biāo)記有免疫標(biāo)記(FITC)的組織細(xì)胞。 注意藍(lán)色自體熒光的組織結(jié)構(gòu)。 右:使用窄帶藍(lán)(490nm)光照射epi照射的FITC標(biāo)簽具有相同的組織和相同的免疫染色。 注意增加的圖像對(duì)比度(Ploem,1967)。

圖5:左側(cè):用寬帶UV激發(fā)照射標(biāo)記有免疫標(biāo)記(FITC)的組織細(xì)胞。注意藍(lán)色自體熒光的組織結(jié)構(gòu)。右:使用窄帶藍(lán)色(490nm)光照射epi照明的FITC標(biāo)簽具有相同的組織和相同的免疫染色。注意增加的圖像對(duì)比度(Ploem,1967)。



考慮到這些事實(shí),現(xiàn)在有可能通過(guò)應(yīng)用藍(lán)色和綠色的窄帶激發(fā),利用普通高壓汞弧燈供電,利用落射照明的優(yōu)點(diǎn)。這種增強(qiáng)滿足了即將到來(lái)的生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)熒光顯微鏡的需求。 

Leitz出于應(yīng)用Ploem的發(fā)明,設(shè)計(jì)了一種新型的多波長(zhǎng)熒光落射照明裝置,配有四個(gè)旋轉(zhuǎn)的二向色分光鏡,可以在紫外線,紫色,藍(lán)色和綠色的光線范圍內(nèi)激發(fā)樣品:Leitz PLOEMOPAK。

Leitz員工W. Kraft完成了進(jìn)一步的成就,他將一個(gè)二向色分束器與適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)和發(fā)射過(guò)濾器結(jié)合在一個(gè)工件中,即所謂的過(guò)濾器立方體或激發(fā)塊(Kraft,1969 und Kraft,1972) 6)。他的調(diào)查結(jié)果是設(shè)計(jì)了一個(gè)落射照明器,其中有幾套這樣的濾光片立方體,它們?nèi)匀皇钱?dāng)今所有多波長(zhǎng)熒光顯微鏡的基礎(chǔ)。



圖6:左圖:Leitz員工W. Kraft于1970年左右將激發(fā)濾光片(橙色),二向色分光鏡(灰色)和發(fā)射濾光片(紫色)放在一個(gè)工件 - 濾光片立方體中。 中間:過(guò)濾器立方體的工程圖。 右圖:在現(xiàn)代顯微鏡下,熒光濾光片立方體可以輕松地進(jìn)出。 研究人員甚至可以根據(jù)自己的需要,用不同的濾光片和二向色分光鏡來(lái)修改立方體。

圖6:左圖:Leitz員工W. Kraft于1970年左右將激發(fā)濾光片(橙色),二向色分光鏡(灰色)和發(fā)射濾光片(紫色)放在一個(gè)工件 - 濾光片立方體中。中間:過(guò)濾器立方體的工程圖。右圖:在現(xiàn)代顯微鏡下,熒光濾光片立方體可以輕松地進(jìn)出。研究人員甚至可以根據(jù)自己的需要,用不同的濾光片和二向色分光鏡來(lái)修改立方體。



概要

憑借Ploem及其同時(shí)代人和接班人共同構(gòu)建的技術(shù)基礎(chǔ),我們今天享受到通過(guò)將足夠的濾光片放入落射照明器中觀看無(wú)數(shù)不同熒光團(tuán)的特權(quán)(圖7)。研究人員甚至可以建立自己的立方體,根據(jù)需要定制激發(fā)和發(fā)射參數(shù)。

由于現(xiàn)代研究顯微鏡的自動(dòng)化,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中切換濾光片立方體不過(guò)是點(diǎn)擊一個(gè)按鈕??茖W(xué)家們可以在不同熒光基團(tuán)之間切換,因此甚至可以觀察到不同基因表達(dá)熒光標(biāo)記的活標(biāo)本。


圖7:熒光顯微鏡的演變。 左:透射光的熒光顯微鏡的基本問(wèn)題是激發(fā)光的檢測(cè)。 中間:這就是為什么人們利用落射照明將光源移動(dòng)到顯微鏡的檢測(cè)側(cè)。 這種方法需要一個(gè)二向色分束器。 右圖:將激發(fā)濾光片,發(fā)射濾光片和二向色分光鏡組合成一個(gè)區(qū)塊便于快速切換專用于某些熒光團(tuán)的不同區(qū)塊。

圖7:熒光顯微鏡的演變。左:透射光的熒光顯微鏡的基本問(wèn)題是激發(fā)光的檢測(cè)。中間:這就是為什么人們利用落射照明將光源移動(dòng)到顯微鏡的檢測(cè)側(cè)。這種方法需要一個(gè)二向色分束器。右圖:將激發(fā)濾光片,發(fā)射濾光片和二向色分光鏡組合成一個(gè)區(qū)塊便于快速切換專用于某些熒光團(tuán)的不同區(qū)塊。