尼康顯微鏡樣品制備和成像
該程序在共聚焦顯微鏡制作和成像標(biāo)本主要來自那些已經(jīng)發(fā)展了許多年的傳統(tǒng)的寬視場顯微鏡用途。 在開發(fā)一個(gè)新的協(xié)議為樣本，以與激光共聚焦顯微鏡成像*好的方法是開始與一個(gè)已知是適合傳統(tǒng)的顯微鏡，并對(duì)其進(jìn)行修改是必要的。
無論所使用的試樣制備的協(xié)議，在其中共聚焦顯微鏡下進(jìn)行的方式的主要優(yōu)點(diǎn)是在圖像顯示和分析的結(jié)果，從同時(shí)采集多個(gè)圖像，以數(shù)字形式，插入計(jì)算機(jī)的靈活性。 這將在下面更詳細(xì)地討論的，但在圖像顯示可能性中的一種優(yōu)雅的例子是在圖1中，一個(gè)三重標(biāo)記的果蠅胚胎在細(xì)胞胚階段。 將試樣免疫熒光標(biāo)記的抗體，以3種不同的蛋白質(zhì)。 后收集在共聚焦系統(tǒng)的紅，綠和藍(lán)色通道3相應(yīng)的圖像，這些圖像可以通過將它們復(fù)制到不同的信道被重新安排。 通過評(píng)估從合并3所產(chǎn)生的圖像中，*有效的顏色到的信道分配用于說明各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域被選擇。圖1給出了合并后的三通道圖像（組合紅色，綠色和藍(lán)色通道）。
大多數(shù)已被證明成功地制備標(biāo)本的常規(guī)寬場光學(xué)顯微鏡的方法是專門旨在降低了焦熒光的量，因?yàn)檫@將產(chǎn)生光暈的圖像，極大地減少了所感興趣的特征的分辨率在。 由于通過共聚焦方法所取得的光學(xué)切片的共焦顯微鏡undersamples在一個(gè)厚的樣品的熒光相比于常規(guī)落射熒光顯微鏡。 其結(jié)果是，樣品可能需要增加染色時(shí)間或染色濃度為共聚焦分析，并且如果評(píng)價(jià)在常規(guī)的顯微鏡，可能表現(xiàn)為過度染色。（本文來源：尼康顯微鏡樣品制備和成像）
雖然在典型的激光掃描共聚焦系統(tǒng)的照明顯得極為明亮，在試樣上的任何給定的點(diǎn)的平均照度為相對(duì)適中，由于這一事實(shí)，即許多點(diǎn)每秒掃描。 以每1.6毫秒一個(gè)點(diǎn)一個(gè)典型的掃描速度，在任何給定點(diǎn)的實(shí)際照度通常比在傳統(tǒng)的寬視場落射熒光顯微鏡更少。 它通常建議使用*低的激光功率是實(shí)際的成像，以保護(hù)熒光。 雖然許多協(xié)議包括一個(gè)antibleaching劑，以防止熒光物種的衰落，這種添加劑可以不要求有許多更現(xiàn)代的共聚焦儀器。
共焦顯微鏡的主要優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用是在較厚的標(biāo)本改進(jìn)的成像能力，雖然成功可以通過試樣的特定屬性來限定。 對(duì)于試樣若干*低物理要求適用，它必須適應(yīng)于顯微鏡載物臺(tái)，和感興趣的區(qū)域必須能夠被放置在物鏡的工作距離范圍內(nèi)。 在某些情況下，分辨率可以具有以容納樣品被破壞，并且要避免損壞它或物鏡。 例如，高分辨率的透鏡，如60X具有1.4的數(shù)值孔徑可以具有170微米的工作距離，而一個(gè)20倍（具有0.75的典型數(shù)值孔徑）可以提供相對(duì)較大的660微米的工作距離，以能夠訪問一個(gè)樣本更禁區(qū)沒有物理干擾。
具有三維結(jié)構(gòu)，它是待研究的共聚焦顯微鏡標(biāo)本，必須被安裝在這樣一種方式，以保護(hù)結(jié)構(gòu)。某種形式的隔板，如漁線或一塊蓋玻片的，通常被放置在載玻片和蓋玻片，以避免變形試樣之間。 當(dāng)活樣品進(jìn)行研究時(shí)，通常需要將它們安裝在一個(gè)腔室，可提供所有的生命必要的要求，而且還允許足夠的訪問由物鏡對(duì)圖像中的所希望的區(qū)域。
物鏡參數(shù)和光學(xué)截面厚度
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表1
樣品性能影響光傳輸，如不透明度和濁度，可以極大地影響激光束入試樣的穿透深度，因此，能夠被成像的結(jié)構(gòu)。 眼睛的未定影的和未染色的角膜上皮，例如，是相對(duì)透明的，激光束將其滲透到約200微米的深度。 與此相反，未定影的皮膚是相對(duì)不透明和散射更多的光，從而限制了激光穿透至約10微米。 許多固定的協(xié)議包括某種形式的清除劑的目的是增加該組織的透明度。
如果有足夠的激光穿透不能與一個(gè)整裝樣品實(shí)現(xiàn)的，厚的部分可以用切片機(jī)進(jìn)行切割。 固定的組織通常用于切片，但組織（如腦活）已減少vibratome并成功地成像。 要訪問一個(gè)部分較深部位安裝，也可以從幻燈片中刪除標(biāo)本，反轉(zhuǎn)它，并重新安裝它，但這通常不是很成功。從樣本的一個(gè)有點(diǎn)較深部分的圖像可以通過使用被激發(fā)在較長的波長（例如花青5），相對(duì)于那些需要更短的波長激發(fā)的染料來獲得。 使用較長波長的照明，然而，將略微減少，可以在比較在更短的波長獲得的圖像來實(shí)現(xiàn)的*大分辨率。 出于同樣的原因，多光子成像技術(shù)允許圖像被從樣本內(nèi)更深的層收集（由于使用的紅色光為激發(fā)）。
物鏡
對(duì)于共焦顯微鏡的研究，所用的物鏡的選擇是極其重要的，因?yàn)橥哥R的聚光能力，測定其數(shù)值孔徑，是既分辨率和光學(xué)部厚度的決定因素。 持有其他顯微鏡變量不變，更高的物鏡的數(shù)值孔徑是，越薄的光學(xué)部分會(huì)。 作為例子，對(duì)于一個(gè)特定的儀器，使用的是60倍（1.4數(shù)值孔徑）物鏡與針孔的直徑設(shè)定在1毫米是約0.4微米的光學(xué)部分的厚度，并且具有16倍（0.5數(shù)值孔徑）透鏡，具有相同的1 - 毫米針孔，截面厚度為1.8毫米的量級(jí)上。 通過打開針孔以較大的直徑，該光學(xué)部的厚度可以增加。 表1給出了光學(xué)部分的厚度值（微米）的各種物鏡在兩個(gè)不同的針孔直徑為研發(fā)中心的一個(gè)模型。 圖像分辨率始終是垂直較差比它水平。 例如，使用60倍，1.4的數(shù)值孔徑，物鏡的水平分辨率為約0.2微米，垂直分辨率為約0.5微米。 場和色差的平整度時(shí)，選擇一個(gè)物鏡被視為額外的鏡頭特性。 在不同波長下成像的多標(biāo)記標(biāo)本時(shí)的色差校正的程度是特別重要的。
物鏡，有能力的*高分辨率通常是那些具有*高放大倍率和*高的數(shù)值孔徑。 它們也是*昂貴的，因此折衷經(jīng)常被掃描試樣的區(qū)域內(nèi)，以及可實(shí)現(xiàn)該區(qū)域的*大分辨率之間進(jìn)行。 如果成像昆蟲胚胎和成蟲磁盤，例如，一個(gè)4倍透鏡可以用來定位在幻燈片上，一個(gè)16倍（0.5數(shù)值孔徑）透鏡成像整個(gè)胚胎，和40倍（1.2數(shù)值孔徑）或60倍的試樣（1.4數(shù)值孔徑）的鏡頭解決胚胎或成蟲盤內(nèi)的各個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核。 用于成像更大的組織，如蝴蝶成蟲盤，4倍帶透鏡將是整個(gè)翼磁盤有用，而40倍或60倍于單個(gè)細(xì)胞的分辨率。 圖2（a）示出了使用了4倍物鏡，以獲得整個(gè)蝴蝶五齡翅成蟲盤的整體圖，并通過一個(gè)16倍的透鏡（圖2（b））所提供的額外核的細(xì)節(jié)。 在該高分辨率和大視場圖像可以被組合的一種方法是獲得許多圖像從相鄰的區(qū)域，并將其數(shù)字化組合成的蒙太奇。 有些顯微鏡具有自動(dòng)，可以設(shè)置走動(dòng)標(biāo)本和收集多個(gè)圖像到一個(gè)大面積的蒙太奇XY階段。
其中比較有用的功能是*LSCMs的特點(diǎn)是使用相同的物鏡放大的圖像，在不損失分辨率的能力。 這種能力是通過減少由激光掃描時(shí)，通過掃描鏡控制試樣的面積，同時(shí)保持相同的圖像的顯示大小或存儲(chǔ)器存儲(chǔ)陣列的大小，有效地增加放大倍率簡單地實(shí)現(xiàn)。 在這樣一些倍數(shù)，而不會(huì)干擾樣品或在視場中失去追蹤的參考點(diǎn)與單個(gè)透鏡來實(shí)現(xiàn)。 只要有可能，然而，更高的數(shù)值孔徑的透鏡，應(yīng)使用的分辨率*大化，而不是使用較低數(shù)值孔徑的透鏡變焦。 用單透鏡（40倍）放大的能力示于圖2（CF）。 圖中的圖（c）顯示了40倍的物鏡（相對(duì)于16倍的視圖面板（二））提供的額外核的細(xì)節(jié)。 至（f）的面板（d）是通過累進(jìn)的，通過減少掃描在試樣上的區(qū)域來完成變焦相同40倍透鏡獲得的圖像。
許多共聚焦儀器設(shè)計(jì)的具有可調(diào)節(jié)的針孔，限制失焦的光到達(dá)檢測器。 打開針孔到直徑較大的生產(chǎn)較厚的光學(xué)部分和分辨率降低，但往往是必要的，以包括更多的樣品細(xì)節(jié)或增加撞擊檢測器的光。 如針孔被關(guān)閉（縮徑），該光學(xué)部的厚度和亮度下降。 分辨率增加，直到一定的*小的針孔直徑達(dá)到，*過此分辨率不增加，但亮度繼續(xù)降低。 針孔直徑是達(dá)到這個(gè)條件是不同的每個(gè)物鏡。
探針共聚焦成像
共聚焦儀器儀表的發(fā)展將繼續(xù)影響兩者并通過了提高免疫熒光定位新型熒光探針的合成受到影響。 熒光正在推出具有激發(fā)和更緊密匹配與大多數(shù)商業(yè)LSCMs提供的激光器產(chǎn)生的波長發(fā)射光譜。 改進(jìn)的探針可以結(jié)合到目前的研究興趣抗體不斷發(fā)展。 作為一個(gè)例子染料組，花青已經(jīng)發(fā)展成為替代其他歷史悠久的染料，用花青3以羅丹明一個(gè)更光明的選擇，花青5發(fā)現(xiàn)在三重標(biāo)簽的策略越來越多地使用。
熒光原位雜交（FISH）在分辨率和探頭檢測再加上激光共聚焦顯微鏡時(shí)，都進(jìn)一步提高了靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，并且是在成像細(xì)胞熒光標(biāo)記的DNA和RNA序列的分布有價(jià)值的方法。 此外，明亮的熒光探針是目前可用于在兩個(gè)細(xì)胞核和染色體分離的總DNA的LSCM成像。
是可用的，當(dāng)在相對(duì)簡單的協(xié)議成立，特異性染色某些細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和大量的熒光探針。 其中可用的探針的過多的染料標(biāo)記的核，高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體和，并且還染靶向肌動(dòng)蛋白聚合的細(xì)胞，如熒光標(biāo)記的phalloidins。 這種染料是在多重標(biāo)記方法非常有用的定位具有特定車廂在細(xì)胞權(quán)益抗原。 例如，圖3給出鬼筆環(huán)肽和核染料（TOPRO）與應(yīng)用于蝴蝶蛹成蟲翅整個(gè)磁盤坐騎三重標(biāo)簽計(jì)劃相應(yīng)抗原結(jié)合的就業(yè)。 如圖3（a）所示，鬼筆環(huán)肽可用于強(qiáng)調(diào)細(xì)胞概述在開發(fā)組織中，與周邊的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被標(biāo)記為明亮的熒光環(huán)。 該圖的圖（b）示出了核染色的只有該細(xì)胞成分的戲劇性的特異性標(biāo)記。 除了這個(gè)細(xì)胞區(qū)室標(biāo)記策略，抗體在細(xì)胞中已知的分布或功能（例如，抗微管蛋白）的蛋白可有效地包含在多標(biāo)記研究。
如果活細(xì)胞進(jìn)行成像，但要注意的熒光染料加入到該系統(tǒng)的作用是至關(guān)重要的。 這些探頭可以是有毒的活細(xì)胞，尤其是當(dāng)他們興奮的激光。 有毒的影響是通過加入抗壞血酸到細(xì)胞培養(yǎng)基中減少一些準(zhǔn)備協(xié)議。 該標(biāo)記的特定細(xì)胞成分可以在成像過程中影響細(xì)胞的活力。 例如，污漬的細(xì)胞核傾向于具有比細(xì)胞質(zhì)染色更有害的影響。 探針可用，活的和死的細(xì)胞區(qū)分（這些之中，吖啶橙），并且可以在成像過程中使用的細(xì)胞活力測定。 大多數(shù)此類測定法是基于的前提是，死細(xì)胞的膜是可滲透的許多材料，如染料，不能穿透它們?cè)诨畹臓顟B(tài)。
熒光-3和RHOD-2是已被合成，以改變?cè)谀承╇x子如鈣的存在下其熒光特性的染料的例子。 新的探針已經(jīng)開發(fā)了用于成像的基因表達(dá)，包括，例如，水母綠色熒光蛋白（GFP），使基因表達(dá)和蛋白定位在體內(nèi)被觀察到。 利用綠色熒光蛋白基因，使基因表達(dá)的監(jiān)測在許多不同的細(xì)胞類型，包括活果蠅卵母細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物（使用激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)激光的488nm的線）。 可用于在multilabeling實(shí)驗(yàn)使用的GFP與頻譜發(fā)生變化的突變體，而這些也發(fā)現(xiàn)使用，以避免干擾自發(fā)熒光的活組織。
自體熒光
組織的自發(fā)熒光天然存在于許多類型的細(xì)胞，并且可以是背景干擾的主要來源成像期間。 例如，葉綠素在酵母和植物細(xì)胞中發(fā)熒光的光譜的紅色部分。 某些試劑如戊二醛固定劑，是自體熒光的來源，這可以通過用硼氫化鈉處理來降低。 自發(fā)熒光有時(shí)可避免使用，可以在波長上是出自然的自體熒光的范圍內(nèi)被激發(fā)的熒光團(tuán)。 花青5通常被選擇，因?yàn)樗窃诩ぐl(fā)波長較長，避免了較短波長的自發(fā)熒光。
雖然這是*經(jīng)常被認(rèn)為是一個(gè)問題，組織自發(fā)熒光可以用于成像的整體細(xì)胞形態(tài)為multilabeling研究的一部分。 從自發(fā)熒光的熒光總量的貢獻(xiàn)可以通過查看未染色標(biāo)本在不同波長并注意到激光功率和黑電平和增益光電倍增管的設(shè)置進(jìn)行評(píng)估。 自體熒光通?？梢云子啥虝罕┞队诩す獾母吖β剩驈墓療舴簽E的標(biāo)本光。 更復(fù)雜的方法來處理的自體熒光，包括使用時(shí)間分辨成像，或去除使用諸如圖像相減的數(shù)字圖像處理技術(shù)。
收錄圖像
共焦顯微鏡的初級(jí)用戶能夠獲得在幾個(gè)方面的經(jīng)驗(yàn)。 由生產(chǎn)商提供的顯微鏡手冊(cè)通常包含一系列必要的入門簡單的程序。 在大多數(shù)的多用戶設(shè)施的主要負(fù)責(zé)人操作儀器可以提供適應(yīng)課程，或設(shè)施經(jīng)理可能需要單獨(dú)使用該儀器前一定專業(yè)水平進(jìn)行短期培訓(xùn)和示范是允許的。 特別要注意對(duì)設(shè)備的內(nèi)部規(guī)則。 信息和培訓(xùn)，也可以從顯微鏡公司進(jìn)行的培訓(xùn)課程，從顯微鏡車間，并從各種出版物得到。
之前的工作與實(shí)驗(yàn)試樣完成的，它是必不可少的熟悉成像系統(tǒng)的基本操作。 它通常是有益的新手開始試成像與一個(gè)相對(duì)容易的標(biāo)本，而不是更困難的實(shí)驗(yàn)之一。 一些更好的測試樣品包括紙浸泡在一種或多種熒光染料或制備的熒光珠。 這兩種類型的試件是明亮的熒光，也比較容易圖象用共焦系統(tǒng)。 另一個(gè)很好的樣本混合花粉，表現(xiàn)出許多不同波長的自發(fā)熒光的幻燈片。 這些可以從花粉從園林植物收集容易地制備，或可以從生物樣品中的供應(yīng)商處購得。 圖4中的花粉粒圖像同時(shí)收集具有相同的PMT中的黑電平與增益和針孔的直徑設(shè)定，但揭示了三種類型的花粉，每個(gè)熒光在不同的激發(fā)波長。 這些標(biāo)本都是作為考試科目有價(jià)值的，因?yàn)樗麄儾粌H有一些有趣的表面細(xì)節(jié)，也維持其性能相對(duì)較好，當(dāng)暴露于激光束。 對(duì)于活組織，從洋蔥上皮細(xì)胞制備標(biāo)本或自來水廠伊樂藻試驗(yàn)。 是可靠的，無論是使用或自體熒光染色DiOC6。
在嘗試成像，共聚焦儀器應(yīng)設(shè)置以獲得*佳的性能。 這需要在優(yōu)化比對(duì)，特別是當(dāng)正在使用的較舊的共焦顯微鏡中的一個(gè)。 使用校準(zhǔn)例程是高度針對(duì)特定的儀器，通常是*好的誰對(duì)維持它的整體責(zé)任的人完成的。 在任何情況下不對(duì)齊從顯微鏡的所有者適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)和許可嘗試。 不當(dāng)?shù)某绦蛴脕韲L試對(duì)齊可能導(dǎo)致梁的完全喪失，并可以在某些儀器的情況下，需要上門服務(wù)，以糾正。
共焦系統(tǒng)是基于傳統(tǒng)的光學(xué)儀器和光學(xué)顯微鏡的基本程序和應(yīng)遵循的做法在任何時(shí)候。 這是極為重要的是，所有的玻璃表面的光路是干凈的，因?yàn)榛覊m，油或油脂的載玻片，蓋玻片和物鏡差圖像的一個(gè)主要原因。 在物鏡和標(biāo)本之間的折射率必須適合于所使用的透鏡。 例如，正確的浸油必須用于一個(gè)給定的物鏡的數(shù)值孔徑，試樣必須被安裝成可在透鏡的工作距離范圍內(nèi)。 蓋玻片厚度必須正確使用的透鏡，尤其是對(duì)于高倍率的物鏡，這需要一個(gè)*或1.5蓋玻片代替第2號(hào)。 蓋玻片必須使用適當(dāng)?shù)?a title='介質(zhì)' target='_blank' class='seolabel'>介質(zhì)被密封在滑動(dòng)，且安裝平面。 指甲油可用于固定試樣，如果是照顧，以確保它是成像前干。 凡士林，蜂蠟，和羊毛脂，或一些其它無毒的密封材料的混合物，必須使用與活標(biāo)本。 遵循嚴(yán)格的基本清潔程序在試樣準(zhǔn)備階段可以節(jié)省大量的時(shí)間和精力以后。
在準(zhǔn)備共焦成像模式，一個(gè)地區(qū)的利益所在要么使用明或常規(guī)熒光顯微鏡。 優(yōu)選使用共聚焦系統(tǒng)的顯微鏡做這個(gè)調(diào)查，但它可以是非常困難的新手單獨(dú)使用共焦成像模式找到正確的焦平面上。 如果傳統(tǒng)的成像模式不可用共焦系統(tǒng)上，那么感興趣的結(jié)構(gòu)可以使用一個(gè)單獨(dú)的熒光顯微鏡的位置，并使用金剛石標(biāo)記在顯微鏡標(biāo)記其位置，標(biāo)記筆，或通過記錄從顯微鏡的位置坐標(biāo)階段。 這是特別有用的，能夠嘗試圖像時(shí)一個(gè)罕見的現(xiàn)象，如在發(fā)展的某個(gè)階段中可能包含數(shù)百個(gè)不同年齡的胚胎標(biāo)本表達(dá)的基因預(yù)覽標(biāo)本共焦系統(tǒng)的實(shí)際顯微鏡。 一個(gè)很大的時(shí)間可以被保存以這種方式，在具有使用共焦模式下掃描許多標(biāo)本。 共聚焦工具通常具有低分辨率快速掃描模式，使初步掃描更有效率。 搜尋在很少發(fā)生的事件時(shí)，*好的方法，但是，是用常規(guī)的顯微鏡模式來掃描載玻片，然后立即切換到共焦模式在相同的顯微鏡采集圖像。
成功的共焦成像依賴于掌握物鏡的數(shù)值孔徑，針孔大小和圖像的亮度之間的相互作用，并且使用*低的激光功率可以達(dá)到*佳的圖像的“秘密”。 新手用戶應(yīng)該嘗試用試樣和不同的放大倍率和數(shù)值孔徑的多個(gè)物鏡企圖對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本成像之前獲得的顯微鏡的能力感改變這些參數(shù)。比較應(yīng)使用共聚焦系統(tǒng)的變焦功能與那些使用具有更高數(shù)值孔徑物鏡獲得所獲取的圖像中。被成像的特定樣品和特征將確定哪個(gè)鏡片和方法是*合適的。適合于共焦顯微術(shù)的許多物鏡的兩個(gè)例子示于圖5。該數(shù)字包括一個(gè)60X planapochromat油浸鏡頭和20倍planfluorite。后者的物鏡有一個(gè)調(diào)整圈，允許它與油，甘油或水被用作浸漬介質(zhì)。
合適的樣品特定顯微鏡的設(shè)置應(yīng)設(shè)置遠(yuǎn)離所關(guān)注的主要區(qū)域，以避免在熒光物質(zhì)中的標(biāo)本有價(jià)值區(qū)域的光漂白。 通常，這需要設(shè)置的增益和光電倍增管檢測器的黑色層次與針孔大小一起獲得可接受的分辨率和足夠的對(duì)比度之間的*佳平衡，使用*低的激光功率以盡量減少漂白。許多儀器利用設(shè)計(jì)設(shè)置正確的動(dòng)態(tài)范圍的圖像，以幫助顏色查找表。 這樣的表的設(shè)計(jì)，使*暗的像素，其在零附近的亮度值，可以*********示為綠色（例如），各路像素，帶亮度值附近的一個(gè)8位的系統(tǒng)255，顯示為紅色。 在顯微鏡參數(shù)，如增益和黑電平，并在針孔的直徑，被調(diào)整以使只有幾個(gè)綠色和紅色的像素在圖像中，從而確保整個(gè)動(dòng)態(tài)范圍為0?255是利用，但很少有在截止亮度范圍的任一端。 雖然這些調(diào)整可以通過眼睛進(jìn)行，在所述成像系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍的兩個(gè)極端的使用偽使得調(diào)節(jié)小得多主觀。 在某些情況下，圖像必須被收集在小于系統(tǒng)的全部動(dòng)態(tài)范圍，因?yàn)樾∮?佳激光功率必須使用或試樣具有不均勻的熒光，導(dǎo)致亮區(qū)域掩蓋調(diào)光區(qū)域，它是在幀中的興趣。
在掃描試樣的圖像平均日常通常使用以減少隨機(jī)噪聲的檢測系統(tǒng)，并加強(qiáng)固定（非隨機(jī)）的特征在圖像中。 一種圖像均衡算法可以采集圖像以它們擴(kuò)展到顯示器的整個(gè)動(dòng)態(tài)范圍的后應(yīng)用。 應(yīng)注意不適用的這種類型的常規(guī)的，如果要作出除非一個(gè)控制圖像被包含在相同的幀作為實(shí)驗(yàn)圖像均衡例程被施加前的熒光強(qiáng)度的測量。 在使用任何類型的圖像處理程序，它是一個(gè)很好的策略，以保存原始未處理圖像除了任何處理的。
在圖像采集通常的策略是將圖像保存到共聚焦系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)的硬盤，后來將它們備份到其他大容量存儲(chǔ)設(shè)備。 一般來說它始終是*好收集盡可能多的圖像盡可能顯微鏡會(huì)話過程中，并在以后的審查丟棄不需要的。 許多似乎沒有必要在首先考慮的圖像經(jīng)過進(jìn)一步的審查（尤其是與同儕）成為非常有價(jià)值的在稍后的日期。 如果它似乎浪費(fèi)采取看似多余的圖像，認(rèn)為它更難準(zhǔn)備另一標(biāo)本，并仍然難以重現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)或確切的條件更加準(zhǔn)確地復(fù)制試樣制備協(xié)議。
成像開始之前的戰(zhàn)略中一個(gè)內(nèi)容豐富的方式標(biāo)記圖像文件應(yīng)當(dāng)制定。 在成像許多筆記應(yīng)采取或添加到圖像文件連同圖像，如果這種能力是可以在系統(tǒng)上使用。 測試應(yīng)該怎樣做才能確保任何保存的信息是保存圖像，同時(shí)要注意文字和相關(guān)圖片等信息時(shí)，它隨后被轉(zhuǎn)移到諸如NIH圖像或Adobe Photoshop上的其他圖像編輯程序可能會(huì)丟失后訪問電腦。 一個(gè)組織良好的筆記本電腦或筆記本電腦的文件可能是*好過的記錄成像會(huì)議的細(xì)節(jié)等手段，并應(yīng)包括文件名，注釋和物鏡的詳細(xì)信息，并用來讓計(jì)算比例尺在日后任何縮放系數(shù)。 大多數(shù)激光共聚焦系統(tǒng)不自動(dòng)記錄所使用的物鏡，而這些信息對(duì)于計(jì)算字段寬度和比例尺后發(fā)表重要。 許多現(xiàn)代系統(tǒng)利用該組織的文件名和文件位置的圖像數(shù)據(jù)庫，這通常會(huì)顯示圖像的縮略圖文件。 必須注意遵循由系統(tǒng)強(qiáng)加圖像命名限制，如文件名，以及是否字符，如句點(diǎn)或空格可能被軟件被誤解允許的字符數(shù)。
故障排除
在任何實(shí)驗(yàn)學(xué)科，已產(chǎn)生了良好的效果的協(xié)議有時(shí)會(huì)莫名其妙地停止工作。 當(dāng)這種情況發(fā)生時(shí)共聚焦成像實(shí)驗(yàn)，有可能是一個(gè)初始的反射責(zé)怪工具，而不是標(biāo)本，但測試應(yīng)進(jìn)行，以確認(rèn)該標(biāo)本是沒有過錯(cuò)任何疑難排解是開始在儀器前。 一個(gè)良好的*項(xiàng)測試是查看在常規(guī)落射熒光顯微鏡標(biāo)本。 如果某些熒光是由眼可見，信號(hào)應(yīng)該是非常光明的正常運(yùn)轉(zhuǎn)的共聚焦系統(tǒng)。 經(jīng)證實(shí)，熒光存在于試樣，然后應(yīng)使用已知的測試樣品而非實(shí)驗(yàn)1進(jìn)行共聚焦系統(tǒng)的一些測試。 為供參考，共焦系統(tǒng)應(yīng)具有試樣接觸到顯微鏡的用戶，包括其收集的所有參數(shù)，如激光功率，針孔的直徑，物鏡和變焦值和增益的圖像的數(shù)字文件和黑電平檢測器。
如果初始測試不提供明確的解決方案，*好是從誰可能都經(jīng)歷過這個(gè)問題的專家尋求幫助。作為一個(gè)規(guī)則，如果用戶是不知道的東西，它是*好的，他們退后一步，嘗試任何補(bǔ)救措施之前，尋求幫助。 所有供應(yīng)共聚焦顯微鏡的公司都有熱線電話和可能的額外的幫助來訪問網(wǎng)站。
被跟蹤的制備協(xié)議問題通常是由試劑的劣化引起的，這應(yīng)該通過進(jìn)行一系列的診斷測試來檢查。 它通常是可取的做實(shí)驗(yàn)，以彌補(bǔ)自己的試劑，或者至少從信任的同事得到它們的人。 抗體應(yīng)該從冷凍的股票在小批量，然后在冷藏條件下儲(chǔ)存分配，而不應(yīng)重復(fù)使用，除非*必要的。 有時(shí)這是不可避免的稀有或昂貴的試劑，而且往往不會(huì)出現(xiàn)問題。
在與多標(biāo)記樣品的實(shí)驗(yàn)中，放氣通過從一個(gè)頻道到另一個(gè)可發(fā)生作為試樣本身的性能的結(jié)果，或者由于出現(xiàn)問題的顯微鏡。 發(fā)表評(píng)論文獻(xiàn)應(yīng)征詢的滲色和可能的補(bǔ)救措施的原因的詳細(xì)信息。 儀器本身的一個(gè)很好的測試包括測試樣品與已知的滲色性的成像，同時(shí)使用多個(gè)標(biāo)簽和單標(biāo)簽設(shè)置。 試樣的圖像應(yīng)該與所有相關(guān)的顯微鏡設(shè)置的記錄被存儲(chǔ)，這樣，當(dāng)問題發(fā)生做測試樣品可以再次成像用相同的儀器條件和與存儲(chǔ)的當(dāng)儀器被稱為記錄比較圖像要優(yōu)化操作。
當(dāng)出現(xiàn)問題時(shí)，可能會(huì)進(jìn)行其它測試包括激光照明的顏色進(jìn)行目視檢查和激光器的陽極電壓的檢查。 如果，例如，一個(gè)多標(biāo)簽設(shè)置在掃描時(shí)從氪/氬激光束出現(xiàn)，而不是白色藍(lán)色那么這可能表明該紅線是微弱的。 在這種情況下，陽極電壓可能會(huì)太高，并且通?？梢酝ㄟ^調(diào)整激光的反射鏡被降低到可接受的水平。 這樣的調(diào)整應(yīng)做由或，負(fù)責(zé)維護(hù)的共聚焦系統(tǒng)的人員的監(jiān)督。 如果電壓不能被帶入一個(gè)可接受的范圍，則可能需要替換為激光。
可能遇到的另一個(gè)問題是，抗體探針可能具有劣化或需再純化或以其它方式清潔。 已制備了一段時(shí)間的標(biāo)本可能發(fā)展增加背景熒光和滲出通過引起從二次抗體的分離和擴(kuò)散到周圍組織中的熒光染料。 如果可能的話，成像應(yīng)進(jìn)行對(duì)新制備的試樣。 有時(shí)候，改變濃度和/或熒光染料的分布將有助于減輕問題。 作為一個(gè)例子，熒光素可能出血進(jìn)入羅丹明信道，并且可以切換成使羅丹明是強(qiáng)信道上。 這樣做的理由是，在熒光素的激發(fā)光譜具有一個(gè)尾部重疊帶和被激發(fā)的若丹明波長范圍。 在隨后的實(shí)驗(yàn)中，次級(jí)的濃度可以降低。
圖像處理和出版
用共聚焦顯微鏡獲得的圖像通常保存在一個(gè)格式，使他們能夠使用提供的共聚焦系統(tǒng)的一部分的專有軟件很容易被操縱數(shù)字的計(jì)算機(jī)文件。其中電流LSCMs的*顯著的改進(jìn)的功能是共聚焦圖像的顯示。這是非常重要的，因?yàn)橛霉步癸@微鏡成像的改進(jìn)的小值，如果沒有辦法有效地顯示圖像或再現(xiàn)它們作為硬拷貝。
就在*近的5年左右前，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室仍在使用傳統(tǒng)的攝影暗室和膠片和紙張化學(xué)處理圖像的*終硬拷貝。有在再現(xiàn)彩色圖像特別的困難，因?yàn)樗麄兺ǔＳ瑟?dú)立的打印機(jī)誰往往有什么構(gòu)成的顯微正確的色彩平衡一點(diǎn)想法印刷和品質(zhì)的打印成本是很高的。獲取圖像的硬拷貝現(xiàn)在，圖像文件可以導(dǎo)出到幻燈片打印機(jī)，彩色激光打印機(jī)，或染料升華打印機(jī)出版的打印質(zhì)量，與直接控制誰收購的人得以維持的形象特征圖像。對(duì)于照片打印或幻燈片可以直接從視頻監(jiān)視器屏幕采取和電影序列可以在網(wǎng)絡(luò)上被公開。
大多數(shù)期刊是現(xiàn)在能夠接受數(shù)碼圖像文件的發(fā)布，這導(dǎo)致在公布圖像質(zhì)量的顯著改善?，F(xiàn)由共聚焦成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了圖像的質(zhì)量可以更忠實(shí)地再現(xiàn)發(fā)表文章。在某些情況下的期刊也使他們的文章可以在CD-ROM，這意味著讀者可以訪問發(fā)布的圖像，正是因?yàn)樗麄兂霈F(xiàn)時(shí)，這些做研究的共聚焦系統(tǒng)收集。毫不奇怪的圖像采集，顯示和發(fā)布的技術(shù)進(jìn)步是特別有益的該期刊的彩色圖像的情況下，現(xiàn)在可以精確地再現(xiàn)圖像的原始分辨率和色彩平衡，并從理論上說，以低得多的成本給作者。