徠卡顯微鏡共焦光學(xué)截面厚度
共聚焦顯微鏡被用來光學(xué)切片同等厚的樣品。 *直接的問題是：1.什么是“同等厚的樣品”和，2. 有多厚實(shí)際上是一種光學(xué)部分？ 這兩個(gè)問題是相關(guān)的，即厚的樣品是assumedly比光學(xué)切片厚至少大約10倍。
在生物樣品可具有任意厚度為10米（整個(gè)動(dòng)物）至10納米（ULTRACUT準(zhǔn)備用于電子顯微鏡）。 如共焦顯微術(shù)是一種入射光線的方法，所述樣品本身的尺寸可以是幾個(gè)厘米或更多，但穿透深度的表面下取決于材料的不透明度和物鏡的自由工作距離。 這就限制了樣本量（Z方向）的考慮到幾毫米在*。
對(duì)于光學(xué)切片的決定因素是衍射極限軸向焦點(diǎn)尺寸。 根據(jù)不同的參數(shù)，在真共焦掃描顯微鏡的光學(xué)切片厚度達(dá)到降低到約 0.5微米。 厚的樣品相對(duì)于0.5微米的切片，然后在5μm以上。 一個(gè)非常典型的數(shù)字為用于標(biāo)準(zhǔn)的共聚焦應(yīng)用（如組織切片），樣本為50微米。
三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）和半*大值全寬度（FWHM）
圖1：全寬度半*大值在z方向上的強(qiáng)度分布（FWHM）被用作光學(xué)切片性能的量度。 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) - 通過一個(gè)足夠小的乳膠珠產(chǎn)生的 - 記錄通過收集力度的xz個(gè)人資料部分。 中的衍射圖案的中心強(qiáng)度分布被顯示（在此為紅色）和50％值之間在Z的距離測量值（綠色指示燈）。
這是一種由光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生的點(diǎn)（點(diǎn)）的圖像被稱為“點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)”（PSF）。 點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)描述了從一個(gè)維數(shù)少斑中的光發(fā)端三個(gè)維度的分布。 該衍射圖案的芯具有一個(gè)橢球的形狀，并控制光學(xué)分辨率。 的徑向尺寸規(guī)則的橫向分辨率，軸向尺寸規(guī)則的焦點(diǎn)深度，因此，平滑性能。
共聚焦切片，目標(biāo)是傳輸PSF，它定義了光學(xué)部分的*的內(nèi)芯。 由于事實(shí)上，針孔直徑控制多少光從芯外面被發(fā)送。 光學(xué)部分，是在衍射圖案的大小的范圍是如此明顯不鋒利的像面包片，但其特征在于由一個(gè)同等持平斜率。 連接上的強(qiáng)度分布的兩側(cè)的50％強(qiáng)度在Z的距離被稱為“半峰全寬”（FWHM），并按照慣例這被用作光學(xué)切片的厚度的測量。光學(xué)切片性能通常通過集中通過表面鏡計(jì)量模型的無限薄的結(jié)構(gòu)在Z。 這個(gè)方法是（同等）方便和用于檢查共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的性能。 或者，更實(shí)際地，Z切片性能是衡量fluorochromated乳膠珠（參見圖1）。 熒光珠允許表現(xiàn)在非相干的條件來衡量，這是真正的熒光成像，因而適合在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)共聚焦絕大多數(shù)應(yīng)用。 在反射光模式（鏡像）的衍射極限的光學(xué)部分是顯著稀釋劑相比，在熒光模式的部分。 這是重要的是要記住，如果從比較文學(xué)的數(shù)字。
參數(shù)控制的光學(xué)切片厚度
在理想條件下，*薄的部分可以實(shí)現(xiàn)只通過光衍射依賴限制。 *明顯的是波長，它控制的PSF的大小成比例：波長越短，越薄切片。 我們可以假定激發(fā)光進(jìn)行限制（而不是發(fā)射的）的波長，如將沒有被照空間外發(fā)射。 第二個(gè)參數(shù)是物鏡（數(shù)值孔徑，NA）的孔徑：較高的NA（收集的信息更寬的角度），越薄的光學(xué)部分。 此外，樣品的折射率影響軸向分辨率并且因此切片性能。 切片的大小DZ對(duì)這些參數(shù)的依賴關(guān)系是由公式圖2中給出。（本文來源：徠卡顯微鏡共焦光學(xué)截面厚度）
第三個(gè)參數(shù)是針孔直徑在檢測路徑，被假定為零對(duì)于上面給出的公式。 因此，這個(gè)公式給出誰也無法預(yù)料的熒光成像的*佳價(jià)值 - 只是理論上的興趣，當(dāng)然：直徑零針孔不會(huì)產(chǎn)生明亮的影像！
圖 2：衍射極限的光學(xué)切片*小厚度從熒光樣品。 針孔直徑被假定為零。 半峰全寬（FWHM）在一個(gè)真正的共聚焦掃描系統(tǒng)。
光學(xué)截面厚度影響
數(shù)值孔徑NA對(duì)切片厚度的顯著（1/square）的影響。 在每平方英尺的徑向延伸線性依賴于NA。 因此，對(duì)于低數(shù)值孔徑的透鏡，滌綸短纖核心變得非常長形和切片很厚。 因此，大多數(shù)應(yīng)用程序都使用浸沒透鏡NA> 1，其中xy和z維度的比例接近2個(gè)大致的一個(gè)因素。 作為一個(gè)經(jīng)驗(yàn)法則，具有高數(shù)值孔徑透鏡的Z部分大約是兩倍的XY分辨率。
理論上的考慮有助于估計(jì)光學(xué)系統(tǒng)的性能。 在現(xiàn)實(shí)中，這兩種儀器和樣品引入從所計(jì)算的數(shù)字偏差。 該儀器必須以獲得*佳性能調(diào)整和精心操作。 和樣品本身就是分辨率的敵人，尤其是如果它涉及到更深層次的成像。 因此格外小心，必須采取折射率匹配，正確的和恒定的溫度和適當(dāng)?shù)纳w玻片的選擇。 該理論將得到一個(gè)經(jīng)驗(yàn)法則，但樣品和設(shè)置可能會(huì)引入顯著偏差 - 經(jīng)常無法回避的，因?yàn)樯飿悠繁染w更復(fù)雜（ - 或真空）。